聯(lián)苯雙酯對小鼠骨髓細胞輻射損傷的防護作用研究

董輝++侯沁蓮+姜道利++唐衛(wèi)生++田真源

[摘要] 目的 探討聯(lián)苯雙酯對輻射致小鼠骨髓細胞損傷的防護作用。方法 體外無菌分離小鼠骨髓細胞，聯(lián)苯雙酯孵育30 min后給予1 Gy照射，18 h后觀察對骨髓細胞的細胞活力、細胞凋亡以及活性氧水平的影響。體內(nèi)實驗C57小鼠分為四組，對照組、聯(lián)苯雙酯組、照射組和照射給藥組。其中照射組和照射給藥組給予4 Gy全身照射，對照組和聯(lián)苯雙酯組給予假照射（0Gy）。聯(lián)苯雙酯組和照射給藥組在受照后灌胃聯(lián)苯雙酯（450 mg/kg），持續(xù)給藥7 d，對照組和聯(lián)苯雙酯組給予相同體積的生理鹽水。在照射第9天取骨髓細胞，計數(shù)單側(cè)股骨骨髓細胞數(shù)量以及觀察骨髓細胞的凋亡、活性氧水平以及克隆形成能力。結(jié)果 體外實驗中，聯(lián)苯雙酯在5 μmol/L有一定的保護作用。在給予1 Gy照射后18 h，與對照組相比，照射組細胞活力顯著下降、凋亡率以及活性氧水平顯著升高（P < 0.05）；與照射組比較，照射給藥組中聯(lián)苯雙酯可提高受照骨髓細胞的細胞活力，降低骨髓細胞凋亡率和活性氧水平（P < 0.05）。體內(nèi)實驗中，與對照組比較，照射組可顯著降低骨髓細胞計數(shù)和克隆形成能力，提高骨髓細胞活性氧水平（P < 0.05）；與照射組比較，照射給藥組中聯(lián)苯雙酯可顯著改善骨髓細胞克隆形成能力，降低骨髓細胞活性氧水平。結(jié)論 聯(lián)苯雙酯可降低骨髓細胞活性氧水平，對骨髓細胞輻射損傷有一定的防護作用。

[關(guān)鍵詞] 輻射；活性氧；聯(lián)苯雙酯；骨髓細胞；細胞凋亡

[中圖分類號] R811.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（a）-0004-05

The protective effects of dimethyl dicarboxylate biphenyl on the mice bone marrow cells exposed to irradiation

DONG Hui HOU Qinlian JIANG Daoli TANG Weisheng TIAN Zhenyuan ZHOU Zewei LI Deguan▲

Institute of Radiation Medicine，Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College，Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine，Tianjin 300192，China

[Abstract] Objective To observe the protective effects of dimethyl dicarboxylate biphenyl （DDB） on the mouse bone marrow （BM） cells in vivo and in vitro. Methods In vitro experiments，the bone marrow cells were isolated and exposed to 1 Gy irradiation after 30 min DDB treatment.Then the cell viabilities，reactive oxygen species （ROS） and apoptosis were detected after 18 h culture.In vivo experiments，the C57BL/C6 mice were divided into control group，irradiated group，DBB treated group and irradiated+DBB group.The mice in the control and DBB group received sham irradiation，and the mice in the irradiated group and the irradiated+DBB group accept 4 Gy total body irradiation. DBB was gavage administrated 450 mg/kg 7d to the mice in the DBB group and the irradiated+DBB. The same volume PBS were given to the mice in the control and irradiated group.After 4 Gy irradiation 9 day， the BM nucleated cell were counted，the ROS，apoptosis and CFU-GM of BM cells were detected. Results In vitro experiments，5 μmol/L DBB showed protective effects.Compared to the control group，the BM cells received 1Gy irradiation 18h showed cell viability decreased，the apoptosis and ROS levels increased（P < 0.05）.The BM cells injuries induced by irradiation were relieved compared to the irradiated group（P < 0.05）.In vivo experiments，the BM cells counts and CFU-GM ability in irradiated mice were decreased，the ROS levels were increased compared to those of control group（P < 0.05）.The BM cells counts and CFU-GM ability was increased，the ROS levels were decreased by DBB treatment compared to those of irradiated group. Conclusion DBB showed protective effects on the bone marrow cells irradiation injury by inhibiting ROS levels.

[Key words] Irradiation； Reactive oxygen species（ROS）； Dimethyl dicarboxylate biphenyl （DDB）； Bone marrow； Cell apoptosis

聯(lián)苯雙酯（dimethyl dicarboxylate biphenyl，DDB）是我國科學(xué)家在研究中藥五味子中發(fā)現(xiàn)的一種新藥，也是人工合成五味子丙素的中間產(chǎn)物，是臨床治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷引起轉(zhuǎn)氨酶升高的常用藥物[1]。前期研究Li發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯雙酯具有清除自由基活性，而Lin則進一步研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯雙酯不僅能提高腫瘤化療敏感性，還能抑制腫瘤細胞，提高腫瘤細胞的凋亡率[2-3]。曹波等則研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯雙酯還具有抗炎功能，能夠抑制Cox-2酶以及IL-4，IL-8等炎癥因子表達[4-8]。Li則發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯雙酯還可引起損傷肝臟中SOD及GSH升高，從而治療肝臟損傷[9]。而聯(lián)苯雙酯在輻射損傷中的作用未見報道。因此本文探討聯(lián)苯雙酯對骨髓細胞輻射損傷的防護作用，并對其作用機制進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 小鼠與分組

C57BL/6L小鼠，雄性，體重18～22 g，10～12周齡，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK（京）2012-0001。購買后飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所SPF級動物房。

1.2 照射及給藥

在體外實驗中骨髓細胞的照射劑量為1.0 Gy。體內(nèi)實驗中小鼠按體重隨機分為對照組，聯(lián)苯雙酯組，照射組和照射給藥組，每組五只，共20只小鼠。其中對照組和聯(lián)苯雙酯組給予假照射（0 Gy），照射組和照射給藥組給予4.0 Gy全身照射。Cammacell-40137 Cs放射源為加拿大原子能公司產(chǎn)品，劑量率約為1.0 Gy/min。所有小鼠在照射后當(dāng)日灌胃給藥。照射后每天給藥1次，持續(xù)給藥7 d，共給藥7次。其中聯(lián)苯雙酯組和照射給藥組小鼠的聯(lián)苯雙酯給藥劑量為450 mg/kg。對照組和照射組的小鼠給予同等體積的生理鹽水。在受照后第9天，取材進行相關(guān)體內(nèi)指標(biāo)檢測。

1.3 試劑與儀器

聯(lián)苯雙酯由藥物室周則衛(wèi)老師贈送；培養(yǎng)基（RPMI1640）及小牛血清購自美國Gibco公司；克隆培養(yǎng)基（M3534）購自加拿大Stem cell公司；活性氧試劑（S0033）購自南京碧云天公司；Annexin V凋亡試劑盒購自美國Ebioscience公司；Cell Titer-BlueTM試劑購自美國Promega公司。日本Olympus倒置顯微鏡，日本Sysmex poch-100i全自動血液分析儀，美國Thermo CO2培養(yǎng)箱。

1.4 細胞活力測定

脫頸處死小鼠，無菌取小鼠雙側(cè)股骨。將骨髓細胞懸液接種96孔板，加入聯(lián)苯雙酯。孵育30 min后，給予1.0 Gy照射，培養(yǎng)18 h檢測細胞活力。

1.5 細胞凋亡檢測

將骨髓細胞按照凋亡試劑盒說明加入Annexin V和PI。室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測。

1.6 單側(cè)股骨有核細胞計數(shù)

無菌取小鼠脛腓骨，反復(fù)沖洗三次。用細胞計數(shù)儀計數(shù)，結(jié)果表示為×106/femur。

1.7 細胞活性氧檢測

骨髓細胞加入活性氧檢測試劑后37℃水浴30 min，用流式細胞儀檢測。

1.8 集落形成能力測定

無菌收集小鼠骨髓細胞，計數(shù)。每組取16×104細胞加入到4 mL M3534培養(yǎng)基中，種24孔板。將24孔板置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)第5天計數(shù)，克隆細胞數(shù)≥30為陽性集落，CFU-GM以每2×104個細胞形成的集落數(shù)表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS15.0進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料以（x±s）表示。多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)苯雙酯對小鼠骨髓細胞活力的影響

觀察聯(lián)苯雙酯對骨髓細胞活力的影響（圖1A）。與0組相比，在0.5～5 μmol/L濃度下，聯(lián)苯雙酯對骨髓細胞有一定的保護作用，在5 μmol/L濃度有顯著保護作用（P < 0.05）；當(dāng)聯(lián)苯雙酯濃度50 μmol/L及以上時，可顯著減低骨髓細胞的細胞活力（P < 0.05）。觀察聯(lián)苯雙酯對體外受照骨髓細胞細胞活力的作用（圖1B）。與對照組相比，照射組和照射給藥組骨髓細胞活力顯著下降（P < 0.05）。與照射組相比，照射給藥組中骨髓細胞活力有明顯升高（P < 0.05），表明聯(lián)苯雙酯在體外可顯著降低輻射對骨髓細胞的輻射損傷。

2.2 聯(lián)苯雙酯對小鼠骨髓細胞數(shù)量及凋亡比例的影響

觀察聯(lián)苯雙酯對小鼠單側(cè)股骨有核細胞數(shù)量的影響（圖2A），與對照組相比，照射可顯著減低小鼠單側(cè)股骨細胞數(shù)量；與照射組相比，照射給藥組可有效緩解輻射引起的骨髓有核細胞數(shù)量的降低（P < 0.05）。在體外實驗中（圖2B），照射可顯著提高骨髓細胞的凋亡率；聯(lián)苯雙酯則可顯著降低照射引起的凋亡率（P < 0.05）。在體內(nèi)實驗中（圖2C），與對照組比較，照射引起骨髓細胞凋亡率增加；而與照射組比較，照射給藥組中受照小鼠骨髓細胞的凋亡率降低（P < 0.05）。以上結(jié)果表明聯(lián)苯雙酯可顯著降低輻射引起的骨髓細胞凋亡，提高受照小鼠中的有核細胞計數(shù)。

2.3 聯(lián)苯雙酯對小鼠骨髓細胞活性氧水平的影響

通過體內(nèi)外實驗觀察聯(lián)苯雙酯對受照骨髓細胞活性氧水平的影響。體外實驗結(jié)果表明（圖3A），與對照組相比輻射可顯著引起骨髓細胞中活性氧的升高（P < 0.05）；而聯(lián)苯雙酯可顯著降低受照骨髓細胞中活性氧的水平（P < 0.05）。在體內(nèi)實驗中（圖3B），盡管輻射引起的活性氧幅度沒有體外高，但與對照組相比，輻射仍可顯著增加受照小鼠骨髓細胞的活性氧水平（P < 0.05）；照射給藥組中小鼠骨髓細胞的活性氧水平顯著低于照射組中骨髓細胞的活性氧水平（P < 0.05）。

2.4 聯(lián)苯雙酯對小鼠骨髓細胞克隆形成能力的影響

照射后第9天，無菌取骨髓細胞接種，進行粒單系集落形成試驗（Colony forming unit granulocyte-mac？鄄rophage，CFU-GM）。與對照組相比，照射對小鼠CFU-GM具有明顯的抑制作用，可引起受照小鼠骨髓細胞克隆形成能力顯著下降（P < 0.05）。而與照射組相比，照射給藥組則可顯著提高骨髓細胞CFU-GM（P < 0.05），表明聯(lián)苯雙酯可提高受照小鼠骨髓細胞的克隆形成能力。見圖4。

3 討論

造血系統(tǒng)對輻射高度敏感，是急性放射病發(fā)病的重要基礎(chǔ)及預(yù)防診治的關(guān)鍵問題，其中骨髓細胞在造血系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[10]。近年來隨著核科技的進步及廣泛應(yīng)用，輻射防護劑研究重新成為熱點。現(xiàn)臨床使用的細胞因子及氨磷汀均存在一些缺陷，因此尋找新的輻射防護藥物成為放射醫(yī)學(xué)亟待解決的問題[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇、黑茶、益氣養(yǎng)陰液等單體、中藥及復(fù)方均對輻射損傷有一定防護作用[13-16]。聯(lián)苯雙酯作為我國科學(xué)家在研究中藥五味子中發(fā)現(xiàn)的一種新藥。本文主要研究聯(lián)苯雙酯對骨髓細胞輻射損傷的防護作用。

本文首先觀察了聯(lián)苯雙酯對骨髓細胞活力以及凋亡的影響。輻射可引起骨髓細胞的凋亡，造成小鼠單側(cè)股骨有核細胞計數(shù)下降[17]。而我們結(jié)果表明，在體內(nèi)外實驗中，聯(lián)苯雙酯均可有效地緩解骨髓細胞輻射損傷，提高受照骨髓細胞活力和股骨有核細胞計數(shù)，降低骨髓細胞的凋亡比例。這提示聯(lián)苯雙酯對造血系統(tǒng)輻射損傷具有保護作用。

前期研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯雙酯可引起損傷肝臟中SOD及GSH升高，對肝臟損傷有治療作用[9]。本研究觀察了聯(lián)苯雙酯對骨髓細胞體內(nèi)外受照后活性氧水平的影響。結(jié)果表明聯(lián)苯雙酯在體內(nèi)外實驗中均可有效降低受照骨髓細胞中的活性氧水平。這可能與先前報道中聯(lián)苯雙酯可引起細胞中SOD以及GSH等具有清除自由基活力酶的表達有關(guān)。

在骨髓細胞中存在大量的造血干細胞與造血祖細胞，其中增造血祖細胞殖活躍，更易受到輻射損傷[18]。CFU-GM檢測骨髓細胞中造血祖細胞的克隆形成能力。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，照射組小鼠骨髓細胞克隆形成數(shù)顯著下降，表明輻射可顯著降低骨髓細胞的克隆形成能力。而與照射組相比，照射給藥組小鼠骨髓細胞的克隆形成數(shù)顯著升高，提示聯(lián)苯雙酯可對骨髓細胞的克隆形成能力有保護作用。

綜上所述，電離輻射可對骨髓細胞造成損傷。我們研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)苯雙酯不僅能夠提高受照小鼠單側(cè)股骨細胞計數(shù)和細胞活力，還能降低受照骨髓細胞中活性氧水平和細胞的克隆形成能力，表明聯(lián)苯雙酯有一定的輻射損傷防護效果，更深層機制有待進一步探討。

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（收稿日期：2016-11-14 本文編輯：杜雪）