高效液相色譜法測定巴中梔子熊果酸含量

齊鶴

摘 要：建立反相高效液相色譜法測定巴中梔子中熊果酸的含量。方法：采用奧泰公司C18色譜柱（220mm×4.6mm，5μm），甲醇-乙腈-磷酸鹽溶液（ 取磷酸二氫鉀1g，加水800毫升溶解，加1毫升磷酸，用水稀釋至1000ml） （5∶85：10）為流動相，檢測波長為210nm，流速為1.0ml/min，柱溫為30℃。熊果酸在0.1～0.55mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。熊果酸平均回收率分別為99.3%。結論：本法簡便、準確，可用于巴中梔子中熊果酸的含量測定。

關鍵詞：梔子；含量；測定

梔子是茜草科植物梔子的果實。梔子的果實是傳統中藥，具有護肝、利膽、降壓、鎮靜、止血、消腫等作用。梔子氣味：苦、寒、無毒。《藥性賦》記載：“味苦，性大寒，無毒。沉也，陰也。其用有二：療心中懊憹顛倒而不得眠，治臍下血滯小便而不得利。易老云：輕飄而象肺，色赤而象火，又能瀉腫中之火。”梔子臨床常用于熱病心煩、黃疸尿赤、血熱吐衄、血淋澀痛、目赤腫痛、火毒瘡瘍等。熊果酸是存在于天然植物中的一種三萜類化合物，具有鎮靜、抗炎、抗菌、抗糖尿病、抗潰瘍、降低血糖等多種生物學效應，熊果酸還具有明顯的抗氧化功能，為梔子主要成分之一。熊果酸具有迅速降低谷丙轉氨酶、血清轉氨酶、消退黃疽、增進食欲、抗纖維化和恢復肝功能的作用[1-5]。梔子生于丘陵山地或山坡灌林中，分布于中南、西南及江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺灣等地。本文采用高效液相法對巴中梔子中的熊果酸的進行了含量測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：EX1600四元低壓梯度液相色譜儀（南京皓而普分析設備有限公司）；B03001-004在線脫氣機（上海笛柏實驗設備有限公司）；HH-601超級恒溫水浴（北京富瑞恒創科技有限公司）；08890-xx超聲波清洗器（北京中科科爾儀器有限公司）；FA1204CFAC型全自動內校電子分析天平（北京同德創業科技有限公司）；ULABO實驗室溫度控制器（優萊博技術（北京）有限公司）；UV1600紫外可見分光光度計（西安華辰樂天實驗室設備有限公司）；實驗室用高純水制備器（北京科譽興業科技發展有限公司）；XSYF-D實驗室廢水處理設備（北京湘順源科技有限公司）。

1.2 色譜柱：奧泰公司C18色譜柱（220mm×4.6mm，5μm）。

1.3 對照品：熊果酸

1.4 試劑：甲醇（上海盈公生物技術有限公司）、磷酸（廣州市西隴化工有限公司）、冰醋酸（廣州市西隴化工有限公司）、醋酸鈉（利津縣東海工貿有限公司）、磷酸二氫銨（上海科豐化學試劑有限公司）、三乙胺（北京亞太龍興化工有限公司）、乙腈（上海科豐化學試劑有限公司）。

1.5 試藥：巴中梔子

2 測定方法確定

2.1 色譜條件

依據查閱文獻及考查的結果，確定色譜條件如下。流動相：甲醇-乙腈-磷酸鹽溶液（取磷酸二氫鉀1g，加水800毫升溶解，加1毫升磷酸，用水稀釋至1000ml）（5∶85：10）為流動相，檢測波長：210nm，流速：1.0m·min-1。柱溫：30℃。理論板數按熊果酸峰計算應不得低于2000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取熊果酸對照品適量，置容量瓶中，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密量取供試品，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，密塞，精密稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，精密稱定，用甲醇補足重量，搖勻，濾過。取續濾液，即得。

2.4 精密度試驗

精密稱取熊果酸對照品適量，加流動相使溶解，制成濃度為0.3mg·mL-1的供試品溶液。照上述色譜條件，精密吸取10μl，連續進樣6次，記錄峰面積。結果，RSD=0.73%，表明本方法精密度良好。

2.5 對照品的線性考察

精密稱取適量熊果酸對照品，加入流動相溶液使溶解分別配制成每毫升含0.1、0.15、0.25、0.35、0.4.、0.45、0.55毫克的溶液。分別精密上述溶液吸取10μL，注人液相色譜儀，依照2.1項下的色譜條件測定，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標，對照品進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，熊果酸在0.1～0.55mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.6 重現性試驗

稱取同一批的梔子樣品6份，按測定方法項下的方法制備供試品溶液，測定含量，并計算樣品的RSD值，結果RSD為0.73%，結果表明此方法的重現性良好。

2.7 準確度試驗

取對照品適量，精密稱取已知含量的樣品9份，置量瓶中，分別精密加入熊果酸對照品，按項下方法制備成110%、120%、130%。取模擬樣品照“含量測定”項下方法試驗，計算回收率為99.3%，RSD為0.85%。

2.8 樣品含量測定

依照上述含量測定方法，再按外標法以峰面積計算樣品的含量，結果樣品的含量分別為0.32毫克/克、0.35毫克/克、0.33毫克/克。

3 討論

分別考察0.04moloL-1磷酸二氫銨溶液-乙腈-三乙胺（60∶40：0.01），甲醇-乙腈-磷酸鹽溶液（取磷酸二氫鉀1g，加水800毫升溶解，加1毫升磷酸，用水稀釋至1000ml）（5∶65：30），甲醇-1%冰醋酸溶液（28∶72），甲醇-乙腈-磷酸鹽溶液（取磷酸二氫鉀1g，加水800毫升溶解，加1毫升磷酸，用水稀釋至1000ml）（5∶85：10）不同比例的流動相，結果以甲醇-乙腈-磷酸鹽溶液（取磷酸二氫鉀1g，加水800毫升溶解，加1毫升磷酸，用水稀釋至1000ml）（5∶85：10）為流動相為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用甲醇-乙腈-磷酸鹽溶液（取磷酸二氫鉀1g，加水800毫升溶解，加1毫升磷酸，用水稀釋至1000ml）（5∶85：10）為流動相為流動相。本實驗采用高效液相法效果好、方法簡便、快捷、準確、專屬性好，可用于巴中梔子中熊果酸的含量測定。

參考文獻

[1]朱萱，中月明.熊果酸對肝星狀細胞增殖與凋亡的影響[A].中華醫學會第11屆全國內科學術會議論文匯編[C].2007.

[2]王婷，宋懷燕，趙德明.熊果酸抗小鼠移植性腫瘤的實驗研究[A].中國畜牧獸醫學會獸醫病理學分會第十四次學術研討會、中國病理生理學會動物病理生理專業委員會第十三次學術研討會論文集[C].2006.

[3]閆天中，靳鳳爍，謝立平，張祥生，李啟忠.熊果酸對前列腺癌細胞雄激素非依賴性的逆轉作用[A].第十五屆全國泌尿外科學術會議論文集[C].2008.

[4]王濤，邵敬偉，陳劍鋒，林鳳屏，郭養浩.枇杷葉中熊果酸的分離純化及抗癌活性研究[A].藥用植物化學與中藥有效成分分析研討會論文集（上）[C].2008.

[5]李利濤，張祥建，崔麗麗，王力娜，劉海超，季輝，杜媛媛.熊果酸在缺血性腦血管病中發揮神經保護作用的機制：激活Nrf2信號通路[A].中華醫學會第十七次全國神經病學學術會議論文匯編（下）[C].2014.