RORα高表達抑制人胃癌MGC803細胞上皮-間質轉化

蘇 堅，趙曉紅，劉 芳，夏 紅，蘇 波，凌 暉，曾 希，蘇 琦

RORα高表達抑制人胃癌MGC803細胞上皮-間質轉化

蘇 堅1,2，趙曉紅2,3，劉 芳2，夏 紅2，蘇 波2，凌 暉2，曾 希2，蘇 琦2

目的 在構建RORα高表達人胃癌MGC803細胞的基礎上，觀察RORα高表達對MGC803細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)的影響。方法 采用相差顯微鏡觀察RORα高表達對MGC803細胞形態的影響。RT-PCR、Western blot、免疫熒光與免疫組化法檢測EMT相關分子表達。裸鼠實驗檢測RORα高表達對移植瘤生長的影響。結果 相差顯微鏡顯示，RORα高表達細胞較MGC803細胞大小較一致，呈圓形或橢圓形，異型性降低。Western blot檢測結果顯示，RORα高表達可明顯下調MGC803細胞Snail蛋白表達(P<0.05)。RT-PCR與Western blot檢測結果顯示，RORα高表達可下調vimentin和上調E-cadherin mRNA與蛋白表達。免疫熒光檢測結果顯示，RORα高表達組細胞Snail與vimentin陽性信號表達較對照組明顯減弱，而E-cadherin陽性信號顯著增強。RORα高表達組移植瘤較對照組生長減慢(P<0.05)，移植瘤體重較對照組明顯降低，抑瘤率為26.55%(P<0.05)。RORα高表達組較對照組癌細胞異型性降低。RORα高表達組較對照組的Ki-67、CD34與vimentin陽性表達均明顯降低，而E-cadherin陽性表達明顯增強。結論 RORα高表達可體內外抑制人胃癌細胞EMT。

胃腫瘤；RORα；人胃癌MGC803細胞；上皮-間質轉化

我國胃癌發生率與病死率位居所有惡性腫瘤的第2位。多數患者就診時已發生侵襲轉移，5年生存率低于10%[1,2]。因此，研究胃癌侵襲轉移機制，尋找靶點具有重要意義。維甲酸相關孤核受體α(retinoid acid receptor related orphan receptor α, RORα)是核受體超家族成員之一，可調節多種正常組織細胞的發育和分化、生物代謝、機體穩態維持及高級神經功能等。并且，RORα在腫瘤中表達下調，與腫瘤發生密切相關，可能是腫瘤治療的靶點[3,4]。本課題組前期實驗發現RORα在胃癌中低表達，與胃癌發生和分化程度有關[5]。本實驗進一步探討RORα高表達對胃癌細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)的影響及其相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人胃癌MGC803細胞由湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室保存，RORα高表達RORα/MGC803細胞與空載體vector/MGC803細胞也由本實驗室構建[6]，分別置于含10%小牛血清的RPMI 1640培養基中，37 ℃ 5%CO2飽和濕度的培養箱內傳代培養。取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒購自OMEGA公司；逆轉錄試劑盒與BCA蛋白定量試劑盒為Promega公司產品；RORα、E-cadherin、vimentin與β-actin抗體購自Abcam公司；Snail、Ki-67與CD34抗體與ECL發光試劑盒購自Santa Cruz公司；新生牛血清購自杭州四季青生物公司。引物用Primer Premier 5.0軟件設計，由上海生工公司合成。羊抗兔IgG-HR和羊抗小鼠IgG-HRP購于凱基生物；羊抗小鼠IgG(H+L)購于Protech生物公司。DAPI和正常山羊血清購于博士德生物公司。MaxVision試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 相差顯微鏡觀察 MGC803細胞與RORα高表達MGC803細胞培養24 h后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。

1.4 RT-PCR Total RNA Kit提取細胞總RNA，AMV酶作用下逆轉錄合成cDNA。設計并合成PCR引物序列：vimentin：F 5′-ACACCCTGCAATCTTTCA GACA-3′，R 5′-AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT-3′，產物長度635 bp；E-cadherin：F 5′-CTCCCAATACA TCTCCCTTCAC-3′，R 5′-CGCCTCCTTCTTCATCATAGTAA-3′，產物長度423 bp；β-actin：F 5′-TCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′，R 5′-GGAACCGCTCATTGCCAATG-3′，產物長度498 bp。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，各基因Tm退火45 s 72 ℃延伸80 s，28個循環；72 ℃ 10 min。5 μL的PCR產物經1%的瓊脂糖電泳，嗅化乙啶染色，通過IS1000圖像分析軟件讀取條帶灰度值，相對值以目的基因與β-actin灰度值之比表示。

1.5 Western blot 收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，每組取等量樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉膜，封閉1 h，加一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，ECL發光，X片曝光、顯影、定影。

1.6 細胞免疫熒光實驗 將對數期的MGC803細胞制成懸液，每孔接種5×105個細胞，待貼壁細胞融合至80%時，棄舊培養基。取出蓋玻片，PBS洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定細胞，常溫下靜置15 min，PBS洗5 min×3次；0.5%Triton覆蓋細胞后，常溫下靜置30 min，PBS洗5 min×3次，吸干凈殘存PBS液；山羊血清封閉，37 ℃孵育1 h；吸凈封閉液，加入一抗，濕盒內4 ℃過夜；第2天移置37 ℃復溫1 h，PBS洗5 min×3次；暗室中加FITC的二抗，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗5 min×3次。染核：將0.4 μg/μL的DAPI覆蓋細胞，常溫下避光靜置2～5 min，PBS洗5 min×3次，甘油封片在熒光顯微鏡下觀察。

1.7 裸鼠成瘤實驗 裸鼠購自北京維通利華實驗動物公司，4周齡雄性，分為MGC803細胞組與RORα高表達組，每組5只。將各組處于對數生長期的細胞密度調至每毫升1×107個，分別取0.2 mL細胞懸液接種于裸鼠腋下。觀察接種后裸鼠進食、飲水、毛發、精神、活動等情況。每隔7天測量移植瘤大小(長徑和短徑)，計算腫瘤體積(V)，V=ab2/2，以每組裸鼠移植瘤體積的平均值，綜合測量數據繪制移植瘤生長曲線。實驗70天時麻醉處死裸鼠，在超凈工作臺上完整剝離腫瘤，稱移植瘤重量，計算瘤重抑瘤率：瘤重抑瘤率=(1-高表達瘤重/對照組瘤重)×100%。移植瘤組織固定于10%中性福爾馬林中。

1.8 免疫組化 免疫組化染色采用MaxVision法，一抗室溫60 min，4 ℃過夜，PBS洗3 min×3次，滴加即用型MaxVision試劑，室溫下15 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，脫水、透明、封固、鏡檢。

2 結果

2.1 相差顯微鏡觀察 相差顯微鏡顯示，MGC803細胞大小不一，大部分呈長梭形，異型性明顯，RORα高表達細胞大小較一致，呈圓形或橢圓形，異型性顯著降低(圖1)。這表明RORα高表達可促進MGC803細胞向上皮轉化。

AB

圖1 RORα高表達對MGC803細胞形態的影響：A.MGC803；B.RORα/MGC803

2.2 RORα高表達對MGC803細胞EMT相關分子的影響 Western blot檢測結果顯示，RORα高表達可明顯下調MGC803細胞Snail蛋白表達(P<0.05，圖2)。并且，RT-PCR與Western blot檢測結果顯示，RORα高表達可下調vimentin和上調E-cadherin mRNA與蛋白表達(P<0.05，圖3、4)。

圖2 RORα高表達對MGC803細胞Snail蛋白表達的影響1.MGC803；2.vector/MGC803；3.RORα/MGC803*P<0.05

圖3 RORα高表達對MGC803細胞vimentin表達的影響1.MGC803；2.vector/MGC803；3.RORα/MGC803*P<0.05

圖4 RORα高表達對MGC803細胞E-cadherin表達的影響1.MGC803；2.vector/MGC803；3.RORα/MGC803*P<0.05

2.3 細胞免疫熒光檢測RORα高表達對EMT相關蛋白表達的影響 免疫熒光檢測結果顯示，Snail蛋白定位胞核，vimentin與E-cadherin蛋白定位于胞質。RORα高表達組細胞Snail與vimentin陽性信號較對照組明顯減弱，E-cadherin陽性信號顯著增強，與Western blot檢測結果一致(圖5)。

2.4 RORα高表達對MGC803細胞裸鼠移植瘤生長的影響 隨著時間的延長，移植瘤體積逐漸增大，而RORα高表達組較對照組生長減慢(P<0.05，圖6)。RORα高表達組移植瘤瘤重(3.90±0.33)較對照組(5.31±0.37)明顯降低，抑瘤率為26.55%(P<0.05，圖7)，表明RORα可在體內抑制MGC803細胞移植瘤的形成。

2.5 RORα高表達對裸鼠移植瘤組織EMT相關蛋白表達的影響 HE染色可見，對照組移植瘤細胞核大深染，核質比大，核分裂較多，異型性明顯；RORα高表達細胞異型性降低，核染色變淺，可見腺樣結構。免疫組化檢測結果顯示，RORα高表達組較對照組的Ki-67、CD34與vimentin蛋白表達均明顯減弱，E-cadherin蛋白表達明顯增強(圖8)。

圖5 RORα高表達對EMT相關蛋白表達的影響

圖6 RORα高表達對裸鼠移植瘤生長的影響

圖7 RORα高表達對MGC803細胞裸鼠移植瘤生長的影響

3 討論

研究認為，RORα在腫瘤中起著抑癌基因的作用。RORα在胃癌、結腸癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、頭頸部癌、白血病等多種腫瘤中表達下調，恢復RORα表達可體內外抑制乳腺癌細胞增殖與侵襲等惡性表型，RORα通過經典與非經典的核受體途徑調控乳腺癌細胞增殖、凋亡與侵襲等功能，提示RORα可能是腫瘤治療靶點[4]。研究結果顯示，RORα在乳腺癌組織與細胞中表達下調，RORα和SEMA3F的mRNA水平減少與不良預后有關。恢復RORα表達可抑制乳腺癌細胞侵襲能力與裸鼠移植瘤生長和SEMA3F表達上調。表明RORα是潛在的腫瘤抑制基因[7]。研究發現，RORα在肝癌組織中表達明顯下調，與血清AFP、病理分級、腫瘤復發、血管侵襲和預后密切相關，并且，RORα高表達可減少肝癌細胞需氧糖酵解和下調生物合成途徑，上調p21，抑制PDK2表達和磷酸化[8,9]。但是，RORα抑制腫瘤細胞遷移侵襲與轉移是否與EMT有關，尚不清楚。

眾所周知，腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力是腫瘤轉移起始的重要步驟，而EMT是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的關鍵。EMT是指在多種細胞因子的共同調節下，具有極性的上皮細胞通過特定程序轉化為具有活動能力間質表型細胞的過程。上皮源性腫瘤細胞通過EMT獲得侵襲和轉移的能力，除發生形態學改變外，細胞與基膜的連接等上皮表型，獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型，如上皮標志物E-cadherin、ZO-1等表達下調，間質標志物vimentin、α-SMA、N-cadherin等上調以及Snail、Slug、Twist等轉錄因子活性增強。此時，腫瘤細胞間的連接變得疏松，細胞骨架蛋白發生重組，細胞黏附能力下降，遷移能力增強，更易于離開原有位置發生侵襲與轉移。因此，腫瘤細胞出現EMT是啟動腫瘤發生侵襲與轉移的關鍵所在，阻止EMT已經成為抑制惡性腫瘤轉移的新治療策略[10,11]。 本組實驗在RORα高表達抑制人胃癌細胞遷移與侵襲的基礎上[6]，進一步探討RORα高表達對胃癌細胞EMT的影響。相差顯微鏡顯示，RORα高表達細胞較MGC803細胞大小較一致，呈圓形或橢圓形，異型性降低。基于Snail、E-cadherin 與vimentin是腫瘤EMT的關鍵分子[12,13]，Ki-67是腫瘤增殖能力的重要指標[14]，CD34是血管形成的標志[15]。本組Western blot檢測結果顯示，RORα高表達可明顯下調MGC803細胞Snail與vimentin和上調E-cadherin表達。免疫熒光檢測結果與Western blot結果一致。體內實驗結果顯示，RORα高表達組移植瘤較對照組生長減慢，體重明顯降低，癌細胞異型性降低，Ki-67、CD34與vimentin陽性均明顯降低，E-cadherin陽性表達明顯增強。上述結果證明RORα高表達通過下調Snail與vimentin和上調E-cadherin表達可體內外抑制人胃癌細胞EMT。

圖8 RORα高表達對移植瘤EMT相關蛋白表達的影響，SP法

研究表明，RORα可通過Wnt5a/PKC、p53-dependent、Hypoxia/Angiogenesis、NF-κB等多種信號途徑調控腫瘤細胞增殖、遷移與侵襲[5]。Lee等報道，RORα通過Wnt5a與PKC依賴方式負調控Wnt/β-catenin通路，抑制β-catenin介導轉錄激活Wnt/β-catenin靶基因功能。RORα可通過絲氨酸35殘基磷酸化，競爭結合β-catenin，抑制Wnt/β-catenin靶基因cyclin D1、c-myc、Axin，從而調控細胞增殖與腫瘤進展[16]。此外，RORα可依賴PGE2/PKCα途徑磷酸化減弱結腸癌細胞Wnt靶基因表達[17]。然而，RORα抑制人胃癌細胞EMT是否通過Wnt/β-catenin途徑調控的詳細分子機制尚待深入研究。

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Overexpression of RORα inhibits epithelial-mesenchymal transformation in human gastric cancer MGC803 cells

SU Jian1,2, ZHAO Xiao-hong2,3, LIU Fang2, XIA Hong2, SU Bo2, LING Hui2, ZENG Xi2, SU Qi2

(1DepartmentofPathology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;2CancerResearchInstitute,CenterforGastricCancerResearchofHunanProvince,KeyLaboratoryofCancerCellularandMolecularPathologyofHunanProvincialUniversity,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;3DepartmentofObstetricsandGynecology,theHainanMaternalandChildHealthHospital,Haikou570206,China)

Purpose To investigate the influence of RORα overexpression on theepithelial-mesenchymal transformation (EMT) underlying construction of human gastric cancer MGC803 cells of RORα overexpression. Methods The morphological effect of MGC803 cells in the overexpression of RORα was observed by phase-microscope. The correlative molecules with EMT were detected by RT-PCR, Western blot, immunofluorescence and immunohistochemistry. The influence of xenograft tumor growth in athymic mice was observed on the overexpression of RORα. Results Phase-microscopy showed that MGC803 cells were size unification, round or ellipse and heteromorphism degrade in the overexpression of RORα. Western blot exhibited obviously the downregulation of Snail protein in the overexpression of RORα (P<0.05). RT-PCR and Western blot disclosed that the overexpression of RORα downregulated notably the expression of vimentin and upregulated E-cadherin mRNA and proteins (P<0.05). Immunofluorescence disclosed that the positive signal of Snail and vimentin protein was attenuate, but E-cadherin was strengthened in MGC803 cells of RORα overexpressiongroup. The xenograft tumor growth was markedly decreased , body weight of transplantation tumor visibly reduced and a inhibition ratio 26.55% (P<0.05) compared with that of the control group. And the protein expression of Ki-67, CD34 and vimentin was obviously decreased and the expression of E-cadherin increased in the RORα overexpression group. Conclusion The overexpression of RORα can remarkably inhibit EMT in MGC803 cellsinvivoandinvitro.

stomach neoplasms; RORα; human gastric cancer MGC803 cells; epithelial-mesenchymal transformation

時間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.014.html

國家自然科學基金(81374013、81102854)

1南華大學附屬第二醫院病理科，衡陽 4210012南華大學腫瘤研究所/湖南省胃癌研究中心/湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，衡陽 4210013海南省婦幼保健院婦產科，海口 570206

蘇 堅，男，碩士，副主任醫師。E-mail: sj5929@163.com 蘇 琦，男，博士生導師，教授，通訊作者。E-mail: suqi1945@163.com

R 735.2

A

1001-7399(2017)02-0143-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.006

接受日期：2016-12-16