ELISA法在植物檢測中的應用研究及改進措施

張黎鳳++馬天文++曹海艷

摘要 酶聯免疫吸附法（ELISA）目前是酶聯免疫技術中應用最廣的方法。詳細分析了ELISA的基本原理，并對其基本類型及在植物病毒檢測中的應用現狀進行了研究。最后在理論分析的基礎上結合工作經驗，從提高ELISA的靈敏度、保持ELISA檢測的穩定性、特異性、檢測的標準曲線方法等方面提出改進策略，并對其發展前景進行展望。

關鍵詞 酶聯免疫吸附法；植物病毒檢測；靈敏度；改進策略

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）24-0137-02

早期植物病毒病的檢測一般采用傳統的生物學方法，而這種單一的生物學檢測病毒的方法需要耗費大量的人力和物力，必須培育大量的接種植物，此法不僅費工費時，而且病毒癥狀表現的時間也較長。因此，尋找靈敏度高、快速、可靠的植物病毒病檢測方法迫在眉睫。自從扇葉病毒向草本寄主轉接獲得成功后，免疫學技術開始蓬勃發展。免疫學技術包括細胞免疫技術、免疫制備技術、免疫血清學技術，其中以血清學技術應用的最為普遍。血清學方法檢測植物病毒是利用血清反應原理實現的。由于每一種植物病毒產生的抗血清都有各自的特性，因此通過已知病毒的抗血清可鑒定病毒種類。酶聯免疫吸附法（ELISA）是血清學技術中應用最為廣泛的一種方法，并已滲透到各個研究領域，該方法是以酶催化的顏色反應來指示抗原抗體的結合[1-2]。由于其具有靈敏、快速、特異性強、分析率高、花費少等優點，可用于大規模樣品調查，因此成為檢測植物病毒的關鍵技術。

1 酶聯免疫吸附法的基本原理

ELISA的基本原理是將酶標記同抗原或抗體物理性地吸附于固相載體表面與酶的催化作用結合，并保持其免疫活性。酶標記的抗原或抗體既保留其反應的特異性，又保留了酶的活性。在測定時，ELISA用固相載體吸附抗原或抗體，固相載體上形成的抗原抗體復合物通過洗滌的方式與液體中的其他物質分開，再加入通過酶標記反應而結合在固相載體上的抗原或抗體，酶結合物與相應的抗原或抗體結合后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，此時待測抗原或抗體與有色產物的量呈一定的比例[3-4]。故可根據底物顯色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法具有很高的敏感度。

2 酶聯免疫吸附法的基本類型

ELISA目前是酶聯免疫技術中應用最廣的技術。ELISA既可以用來測定抗原，也可以用來測定抗體。在使用酶聯免疫吸附法測定時必須具有3種試劑，即固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）、酶標記的抗體或抗原（結合物）、酶作用的底物。從酶聯免疫技術建立開始，經過不斷的改進，已形成了各種不同類型的檢測方法。常用的方法有雙抗體夾心法、競爭法和間接法等。這些方法的靈敏度較高、特異性強，已廣泛用于病毒的檢測。

2.1 雙抗體夾心法測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，適用于檢測多價抗原。樣品中的被檢測抗體分子分別與固相載體上的抗原和酶標記的抗原相結合。包被特異性抗體與固相載體連接，經洗滌加入含抗原的待測樣品使其與過量固相抗體結合，保溫反應，形成復合物。再加入酶標記特異性抗體，保溫反應。抗原與酶標記特異性抗體在固相復合物上相結合，洗滌未結合的。加入底物顯色，酶催化底物顯色，根據顯色程度，求出樣品中抗原的量（圖1）。

2.2 競爭法測抗原

小分子抗原可以采用競爭法檢測抗原。特異性抗體吸附到固相載體的表面，經過洗滌后分為a/b 2種情況：a組加酶標記抗原和被測抗原混合物，經過溫育洗滌后加入底物顯色；b組僅僅加入酶標記抗原，經過溫育洗滌后加入底物顯色。a/b 這2組底物降解量的差就是所要測定的抗原的量（圖2）。

2.3 間接法測抗體

間接法測抗體也是常常采用的方法之一，酶標記抗體檢測各種與抗原相應的抗體。特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原。包被抗原經過洗滌加含有抗體的樣品溫育反應，再洗滌后加入酶標記抗體，溫育洗滌后，加入底物顯色（圖3）。

3 酶聯免疫吸附法的應用

伴隨與其他學科新技術的融合和其本身具有的優點，ELISA得以廣泛的應用。ELISA可以用于檢測一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測定溶液中的可溶性抗原。目前，國內外在ELISA 檢測植物病毒方面做了大量的研究工作。

ELISA在植物病毒中的應用：ElISA技術具有專屬性很強的特點，不僅可以測定不同病毒之間的親緣關系及株系關系，鑒別親緣關系很近的病毒，還可以對同一種病毒的不同的血清類型區分，有助于測定病毒株系和血清型的分化；可研究植物變異株系的分布情況對植物病毒的流行病學進行研究；ELISA病毒檢測是實現無毒化栽培的關鍵，可以通過對樣品的初步檢測，篩選脫毒苗木；ELISA可檢測植物的真菌和細菌；檢測種子的健康，由于靈敏度比較高，可以測定單個種子中的植物病毒抗原，還可以檢測未發芽種子內的某一微小部分如種皮、種胚、胚乳上的病毒，提供快速、準確的種子質量認證和植物檢疫認證，與傳統培養方法相比節約了大量的時間、人力和物力；可以大規模檢測果樹、葡萄、草莓等經濟作物中的病毒；檢測傳播介體、土壤、播種工具中的植物病毒，對病情的預防和及時采取防治措施都有重要的影響；可以檢測自然寄主中的植物病毒；分子生物學中進行樣品的篩選，可以用ELISA區分陰陽性樣品，再用PCR進一步判斷。

4 酶聯免疫吸附法的改進提高

4.1 提高ELISA檢測靈敏度的方法

酶聯免疫反應是一種敏感性很高的反應，ELISA樣品的前處理在檢測中處于重要地位。不同的前處理方式對檢測會產生不同的結果[5]。以植物樣品為例，選取不同的陰性對照、陽性對照和抗血清濃度都會影響到檢測結果。病毒的檢測不僅要選擇合適的檢測方法，而且樣品的取樣部位和取樣時間都會影響檢測結果的準確度。因此，在ELISA分析中樣品的前處理至關重要。根據不同的待測樣品，選取與之適合的前處理方式是建立高靈敏度的檢測方法的首要條件。

抗原、抗體的固相化在ELISA檢測系統中有著重要的地位，親和力常數越高，ELISA方法靈敏度就越高。抗原、抗體的固相化是固相免疫測定的前提。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，物理吸附技術是一種簡單的固定技術，但在此過程中會發生折疊，惰性蛋白封閉劑會遮蔽功能部位，進而影響了生物分子的功能，檢測的靈敏度就會受到影響。化學共價偶聯方法比物理吸附方法的固定強度高、特異性好，可以提高ELISA檢測的靈敏度。提高ELISA檢測的靈敏度需要采取合適的方法制備出親和力強的抗體，先進的固相化技術，為抗原或抗體提供適當的環境[6-7]。

4.2 保持ELISA檢測的穩定性

穩定劑一般由蛋白質、緩沖液、糖類、防腐劑和其他一些能夠起穩定作用的物質組成。商業化免疫檢測試劑的酶結合物穩定劑大多不公開，性能也存在著一定的差異，開發出性能較好的酶結合物穩定劑，是維持免疫檢測穩定性的關鍵環節。

4.3 確保ELISA檢測的特異性

在選擇ELISA檢測方法的抗體時，應該避免選用交叉反應嚴重的抗體以確保檢測的特異性。在保證檢測靈敏度的前提下，調整好合適的酶濃度控制好檢測背景，可確保ELISA檢測的特異性。

4.4 ELISA檢測的標準曲線

ELISA操作步驟繁復，影響試驗結果的因素較多，固相介質表面的吸附能力和抗原、抗體之間的相互作用是直接影響ELISA檢測結果的關鍵性因素。因此在定量測定時，不同的樣品用不同濃度的參考標準品在同等條件下制定標準曲線，擇適當的檢測區域。

一般的信號系統是通過酶催化底物顯色，通過顯色的情況對被檢測的物質進行分析。一些微量待測物質在樣品中的含量比較低，在樣品的前處理過程中可能存在提取不徹底等原因，致使ELISA的信號系統對待測物不能準確的定量。可通過使用信號放大系統進行修正。合理的信號放大有利于提高ELISA檢測的靈敏度。

5 展望

ELISA方法具有選擇性好、靈敏度高、設備價格便宜、折舊損耗小等請多的優點，在人類、動物、植物、微生物、環境檢測等領域都有廣泛的應用。但是ELISA技術也有其局限性和不足。而生物技術發展迅速，如dsRNA分析、分子雜交、PCR等分子生物學技術的發展應用，使得病毒檢測的方法得到補充和完善。相信在各個領域里會有廣泛的應用前景。

6 參考文獻

[1] 于紹夫.酶聯免疫吸附測定法檢測果樹病毒研究進展[J].落葉樹，1995（2）：9-22.

[2] 青玲，劉映紅，馬麗娜，等.武隆煙區煙草病毒病的病原初步鑒定[J].西南農業大學學報，2005，27（3）：220-221.

[3] 焦奎，張書圣.伏安酶聯免疫分析及其在植物血清學檢測技術中的應用[J].化學通報，2000，64（10）：50-54.

[4] 魏梅生.植物無性種質材料中病毒的檢測與治療[J].世界農業，1995（10）：30-33.

[5] 陳建軍，李培睿，楊向英，等.DAS-ELISA和PAS-ELISA檢測GFLV的技術研究[J].河南農業科學，2004（11）：48-51.

[6] DONG N，DONG J，LIU P，et al.Effects of anticoagulants on human pla-sma soluble corin levels Measured by ELISA[J].Clin Chim Acta，2010， 411（23-24）：1998-2003.

[7] JONE R A C，TORRANCE L.Developments And Applications In Virus Testing[M].Wellosboume，Lavenham Press，1986.