川芎嗪抑制大鼠腦缺血再灌注損傷的機制

李鵬飛 沈梅紅 吳錦萍 張春兵

(南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科，江蘇 南京 210029)

·基礎研究·

川芎嗪抑制大鼠腦缺血再灌注損傷的機制

李鵬飛 沈梅紅1吳錦萍2張春兵2

(南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科，江蘇 南京 210029)

目的 探討川芎嗪(TMP)抑制腦缺血再灌注損傷(CIRI)的分子機制。方法 選擇清潔級健康成年雄性SD大鼠，采用改良的Zea Longa栓線法構建大腦中動脈梗塞(MCAO)模型，并將大鼠隨機分為三組(n=20)：假手術組、模型組、TMP治療組。假手術組大鼠不插入線栓，其余操作均同模型組；TMP治療組大鼠在被拔出線栓再灌注時，腹腔注射TMP 20 mg/kg。再灌注24 h后，各組大鼠進行神經功能評分，然后麻醉處死，取材檢測。干濕稱重法檢測大鼠腦組織含水量；2，3，5-三苯基氮化四氮唑(TTC)染色法檢測大鼠腦梗死面積，HE染色觀察腦組織形態；熒光定量PCR檢測大鼠梗死側腦皮層中miR-199a-5p、Bax、Bcl-2、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6 mRNA的表達水平；酶聯免疫法檢測大鼠血清中炎癥介質TNF-α、IL-1β和IL-6的含量；免疫組化法觀察大鼠梗死側腦皮質核轉錄因子(NF)-κB p65及磷酸化NF-κB p65(NF-κB p-p65)的表達。結果 TMP治療可顯著改善神經缺陷評分(P<0.05)，降低腦組織含水量(P<0.05)，減少梗死體積(P<0.01)，減輕腦組織破壞。模型組miR-199a-5p、Bax、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。而TMP治療可顯著降低miR-199a-5p、Bax、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達水平(P<0.05)，增加Bcl-2 mRNA的表達(P<0.05)。與模型組比較，TMP治療組大鼠腦皮質和血清中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子含量均顯著降低(P<0.05)。IHC結果顯示，TMP治療組中NF-κB p-p65陽性細胞數明顯減少(P<0.05)。結論 TMP可減輕CIRI，其機制可能為抑制miR-199a-5p的表達，減少凋亡，降低炎癥反應，且可降低NF-κB的活化。

川芎嗪；腦缺血再灌注損傷；凋亡；炎癥

在腦缺血過程中，由于營養物質的急劇缺乏以及氧供不足可導致神經死亡。腦缺血后血流的恢復在某些情況下反而會導致進一步的組織損傷和功能障礙，這種恢復血流灌注后的有害情況稱為腦缺血再灌注損傷(CIRI)〔1～3〕。我們前期綜述發現，中藥有效成分可以多層次地多靶向抑制CIRI〔4〕，其中，川芎被稱為血中之氣藥，具有活血行氣、消散淤血、祛風止痛之功效，其主要活性成分為川芎嗪(TMP)，學名2，3，5，6-四甲基吡嗪。TMP在臨床上廣泛應用于治療和預防缺血性心腦血管性疾病〔5〕。有研究表明，TMP具有多種藥學性能如抗炎、鈣拮抗、清除氧自由基及抗氧化損傷等〔6～8〕。微小核糖核酸(miRNA)表達紊亂是缺血性腦卒中(IS)發生發展的重要原因〔7〕。本課題組前期研究發現急性IS患者外周血血清中miRNAs的表達與健康人群有顯著差異，且這些miRNAs在CIRI中扮演重要的角色〔8〕。有文獻報道miR-199a-5p特異表達于神經組織中〔9〕，并參與神經再生、神經突起、突觸可塑性等重要環節〔10〕。最新研究發現，TMP能改善脊髓損傷功能修復，降低神經凋亡，主要是通過miRNA發揮作用〔11，12〕。本文將探討TMP減輕CIRI是否與miR-199a-5p有關。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品與試劑 鹽酸川芎嗪注射液購自無錫市第七制藥廠；栓線購自北京沙東生物科技有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)購自美國Amresco公司；10%水合氯醛購自上海國藥集團化學試劑有限公司；PrimescriptTM RT-PCR Kit反轉錄試劑盒購自大連寶生物公司；TRIzol購自上海Invitrogen公司；mRNA、miRNA熒光定量檢測試劑盒購自瑞士Roche公司；兔抗大鼠核轉錄因子(NF)-κB p65、磷酸化NF-κB p-p65(NF-κB p-p65)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體購自美國Abcam公司；大鼠白細胞介素(IL)1-β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.2 實驗動物分組及處理 選擇清潔級健康雄性SD大鼠，體重(280±20)g，由北京維通利華動物實驗有限公司〔許可證號SCXK(京)2012-0001〕提供。所有大鼠飼養于SPF級動物飼養環境〔12 h/12 h晝夜節律、(22±2)℃室溫、50%～60%濕度、通風良好〕，適應性飼養1 w，大鼠自由攝食與飲水。術前大鼠禁食12 h，可自由飲水。采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、TMP治療組。假手術組：大鼠所有操作與模型組大鼠一致，但是不用插入線栓。模型組：大鼠所有操作如下1.3所示，腦缺血2 h，再灌注24 h。TMP治療組：大鼠線栓拔出，再灌注時腹腔注射TMP 20 mg/kg。

1.3 大鼠局灶性CIRI模型的建立 采用Zea Longa改良栓線法〔13〕。 SD大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉，仰臥固定。頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，仔細分離避免損傷迷走神經。由頸外動脈遠心端結扎頸外動脈，用微型動脈夾夾住頸總動脈近心端及頸內動脈，在靠近頸總動脈分叉處用眼科剪在頸外動脈上剪一小口，將直徑0.23～0.26 mm釣魚線用線香燒成小球的一端沿小切口插入頸外動脈，剪斷頸外動脈遠心端，將頸外動脈反向拉直，使其與頸內動脈處于同一直線上，移去頸內動脈的動脈夾，經頸總動脈分叉處將魚線緩慢向頸內動脈入顱腦內的方向推進約(18±0.5)mm，微遇阻力時停止，使魚線頭端到達較細的大腦中動脈起始處。縛緊預先放置于穿刺小切口處的絲線，縫合，消毒，缺血2 h后拔出栓線，建立CIRI模型。假手術組大鼠只分離暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈。所有大鼠在術前禁食12 h，自由飲水。

1.4 神經功能缺陷評分 使用Zea Longa五分評分標準(1989年)〔13〕，在大鼠拔出線栓后初步判斷模型是否成功。對各組大鼠進行神經功能評分：0分，正常，無神經學征象；1分，出現Honer征；2分，拎起大鼠尾巴時大鼠左前肢不能伸展；3分，一側肢體不完全癱瘓，大鼠向左側轉圈；4分，一側肢體完全癱瘓，大鼠向左側傾倒；5分，死亡。其中神經功能評分≥2分者納入實驗組，評分為0分或是5分者剔除。

1.5 大鼠腦梗死面積計算 各組大鼠(n=5)經10%水合氯醛腹腔注射麻醉后迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦等其他組織。取出腦組織后，置于-20℃冰凍15 min。將大腦沿冠狀面切成5等份腦片，置于2%的TTC生理鹽水溶液中37℃避光孵育30 min，10%甲醛中性緩沖液(pH7.4)固定過夜。TTC染色后，正常腦組織呈玫紅色，梗死組織呈白色。使用微距相機拍攝，Image J圖像分析軟件計算并統計各組大鼠腦梗死面積百分比。計算公式：腦梗死面積百分比=梗死灶面積/全腦面積×100%。

1.6 大鼠腦含水量測定 實驗動物再灌注24 h后，每組各取5只斷頭取腦，濾紙吸盡表面血漬后銳性刀片分離左右半球，將損傷側半球的腦組織用電子分析天平稱其濕重后置于106℃恒溫干燥箱內持續干燥24 h后稱其干重，腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 蘇木素-伊紅(HE)染色檢查腦組織病理學改變 每組大鼠(n=5)經10%水合氯醛腹腔麻醉后，迅速經左心室依次使用0.9%氯化鈉鹽溶液250 ml和250 ml 4%多聚甲醛溶液灌注固定到大鼠身體發僵后，迅速斷頭取出腦組織標本。腦組織標本保存于4℃的10%中性甲醛溶液中。24 h后依次經脫水、透明、石蠟包埋，由切片機連續切取6 μm的冠狀腦組織切片，后經過脫蠟、HE染色等步驟后，置于Olympus BX50生物光學顯微鏡(×400)下隨機選取5個視野觀察形態學變化。

1.8 免疫組織化學染色檢查腦皮質NF-κB p65、NF-κB p-p65的表達 將包埋好的石蠟塊置于石蠟切片機，將蠟塊由前向后作大腦冠狀切片，每片厚5 μm，收集腦片。選擇完好腦片貼于已涂有多聚賴氨酸的載玻片上，晾干使腦片緊貼，以防脫片。每只動物取1張腦切片進行免疫組織化學染色，按免疫組化測試盒操作說明進行操作。光學顯微鏡觀察大鼠缺血側腦皮質，并用Olympus顯微圖像獲取系統400×拍攝圖像。每張切片隨機觀察5個不同視野，計算5個視野中總的陽性細胞數，即為該動物的陽性細胞數。采用南京大學捷達軟件公司圖像分析系統測定視野中陽性細胞的平均灰度、平均光密度，計算積分光密度值(IOD)，以評估陽性細胞中的蛋白含量變化。

1.9 實時定量PCR檢測Bax、Bcl-2、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA以及miR-199a-5p的表達 大鼠在10%水合氯醛麻醉下，快速斷頭取腦，迅速浸于冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗去表面血液。將取出的大腦置于濾紙上(濾紙置于冰上)，用手術剪取腦皮質層裝入eppendorf管，立即置于液氮。采用Trizol法提取各組總RNA，使用核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的完整性后，逆轉錄成cDNA。

mRNA逆轉錄反應體系(20 μl)：5×PrimescriptTM緩沖液4 μl，PrimescriptTM RT Enzyme Mix I 1 μl，Oligo dT Primer 1 μl，Random 6 mers 4 μl，總RNA RNase Free H2O 10 μl。逆轉錄反應條件：37℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。使用Roche公司熒光定量檢測試劑盒，按照試劑說明書進行實時定量PCR。 PCR反應體系(20 μl)：2×熒光定量探針法反應預混液 10 μl，20×探針和擴增引物預混液1 μl，模板cDNA 1 μl，RNase Free H2O 8 μl。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火、延伸1 min，擴增40個循環；在退火、延伸步驟中采集熒光信號。β-actin作為內參。

MiR-199a-5p的逆轉錄條件(20 μl體系)：5×PrimescriptTM緩沖液4 μl，PrimescriptTM RT Enzyme Mix 1 μl，miRNA RT Primer 1 μl，RNase Free H2O和總RNA 14 μl；反應條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。使用Roche公司熒光定量檢測試劑盒，按照試劑說明書進行實時定量PCR。PCR反應體系(20 μl)：2×熒光定量探針法反應預混液10 μl，20×探針和擴增引物預混液1 μl，模板cDNA 1 μl，RNase Free H2O 8 μl；反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火、延伸1 min，擴增40個循環。在退火、延伸步驟中采集熒光信號，U6 snRNA作為內參，所有結果重復三次。結果分析用十二烷基硫酸鈉(SDS)software version 2.0，分析條件設置：根據分析后圖像調節Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值，在analysis菜單下選擇analyze自動分析結果。采用相對定量法(2-ΔΔCT)計算各目的分子的相對表達量。

1.10 ELISA檢測炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量 各組大鼠再灌注24 h后，各取5只迅速斷頭取腦，留取血液，室溫下放置2 h后，3 000 r/min離心20 min，去上清，-80℃保存。血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量的測定按照ELISA 試劑盒說明書進行操作。

1.11 統計學方法 采用Graphpad Prism 5.0軟件，組間比較用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1 TMP對大鼠神經功能評分的影響 模型大鼠24 h再灌注后，其神經功能缺陷評分明顯增加(3.00±0.89，假手術組為1.00±0.00，P<0.001)；TMP治療后，可以顯著改善模型大鼠神經功能(1.83±0.75,P<0.05)。

2.2 TMP對大鼠腦梗死體積的影響 與模型組腦梗死體積〔(35.50±1.68)%〕比較，TMP治療組腦梗死體積〔(26.04±1.36)%〕顯著下降25.61%(P<0.01)。

2.3 TMP對大鼠腦組織含水量的影響 腦組織含水量分別為：假手術組(79.24±0.419)%、模型組(82.25±1.640)%、TMP治療組(80.30±1.286)%。與假手術組相比，模型組腦組織含水量顯著升高(P<0.01)，而經TMP治療后大鼠腦組織含水量顯著改善(P<0.05)。

2.4 TMP對大鼠腦組織形態的影響 腦組織HE染色結果顯示：神經細胞質染色呈淡紅色，胞核染色呈紫藍色。假手術組大鼠腦組織形態結構正常，可見神經錐體細胞數量多，胞質豐富，細胞核大而圓，未見病理性損傷。模型組大鼠腦組織神經細胞縮小變形，細胞核固縮深染，核固縮呈三角形或不規則形狀，部分胞核和胞質界限不清；神經組織間質水腫明顯，組織結構被破壞疏松呈網狀，染色淺淡，甚至在部分紅染區域僅見到無明顯結構的壞死組織。TMP治療組腦組織破壞情況得到了改善，僅可見少量不同程度被破壞的神經細胞。見圖1。

圖1 各組大鼠腦皮質HE染色結果(×400)

2.5 TMP對大鼠腦皮質miR-199a-5p的影響 與假手術組(0.98±0.15)相比，模型組中miR-199a-5p的表達(2.32±0.55)顯著上調(P<0.001)，TMP治療組miR-199a-5p表達(1.67±0.41)顯著下調(P<0.05)。

2.6 TMP對大鼠腦皮質Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響 與假手術組(Bax:0.95±0.19，Bcl-2:0.95±0.21)比較，模型組腦皮質中Bax RNA表達(2.95±0.62)上調，Bcl-2 mRNA表達(0.50±0.14)明顯下降(P<0.01)；TMP治療后，Bax mRNA表達(1.88±0.32)得到顯著抑制(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達水平(1.63±0.30)明顯上升(P<0.001)。

2.7 TMP對大鼠腦組織和外周血TNF-α、IL-1β和IL-6表達水平的影響 qRT-PCR結果顯示，與假手術組(分別為1.05±0.20，0.80±0.26，0.94±0.05)比較，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(2.95±0.18，2.38±1.03，3.20±1.28)顯著升高(P<0.01，P<0.05)；TMP治療后，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達(0.95±0.19，0.64±0.19，0.54±0.17)均顯著降低(P<0.01，P<0.05)。

ELISA結果表明，模型組大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達含量〔(52.00±19.09)、(152.70±58.36)、(105.60±10.36)pg/ml〕比假手術組〔(23.00±6.60)、(61.48±7.96)、(66.00±3.11)pg/ml〕顯著升高(均P<0.01)；與模型組相比，TMP治療組各因子的表達含量〔(29.60±7.27)、(62.93±11.74)、(79.00±5.14)pg/ml〕均顯著降低(P<0.05)。

2.8 TMP對大鼠腦組織中NF-κB p65、NF-κB p-p65的影響 免疫組織化學結果表明，在模型組大鼠腦皮質中可明顯觀察到NF-κB p65及NF-κB p-p65陽性細胞。與假手術組(38.00±1.47,28.00±2.25)相比，模型組大鼠腦皮質中NF-κB p65(53.00±2.48)及NF-κB p-p65(56.25±3.12)表達明顯升高(P<0.01，P<0.001)；TMP治療后，NF-κB p65及NF-κB p-p65表達(47.25±2.78、42.00±3.49)顯著降低(P<0.05)。見圖2，圖3。

圖2 各組大鼠腦皮質中NF-κB p65的表達(IHC法，×400)

圖3 各組大鼠腦皮質中NF-κB p-p65的表達(IHC法，×400)

3 討 論

腦缺血再灌注24 h后，可出現明顯腦水腫、大面積梗死灶，神經元發生大片壞死、凋亡，細胞結構受損嚴重。本文發現TMP能夠顯著改善腦水腫、減少腦梗死面積以及改善神經組織的損傷，充分表明TMP具有一定的神經保護作用。IS引起一系列細胞和分子事件級聯反應，包括神經興奮性毒性、鈣離子超載、氧化應激以及神經炎癥〔14〕。多種體內外實驗可以證實TMP能阻斷多個損傷級聯事件，提供神經保護作用〔15〕。凋亡與CIRI密切相關，抑制凋亡可以減輕缺血腦損傷，對腦組織具有保護作用。Kao等〔4〕發現，TMP能抑制腦缺血誘導的凋亡。Chang等〔16〕報道TMP可抑制MCAO誘導的Caspase3活化及細胞凋亡，從而降低梗死面積。同時，有文獻證實，在兔子脊髓缺血模型中，TMP可以通過增加Bcl-2和降低Bax的表達發揮抗凋亡作用〔17〕。我們團隊前期體外實驗結果表明，TMP也可有效調節Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9的表達而發揮神經保護作用〔18,19〕。本文通過體內實驗觀察到TMP可改善神經組織損害情況，降低Bax和上調Bcl-2的表達，證實TMP可以降低神經細胞凋亡。炎癥反應是腦缺血后腦損傷的主要原因之一，控制缺血后炎癥級聯反應顯得尤為重要。促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6是CIRI早期分泌釋放的細胞因子，它們表達上調是腦缺血后炎癥級聯反應的始動因素。Wu等〔20〕發現，TMP能下調TNF-α及細胞間黏附分子-1的表達，從而降低炎性反應。Liao等〔21〕發現，TMP通過抑制小膠質細胞、星形膠質細胞及其他炎癥細胞的活化、遷移及聚集，發揮神經保護作用〔16〕。Chang等〔16〕發現TMP抑制TNF-α的表達，對神經元發揮保護作用。本文研究也發現TMP可以降低腦缺血再灌注過程中炎癥反應，發揮神經保護作用。炎癥反應的發生主要以NF-κB信號通路為核心和關鍵。NF-κB參與腦缺血再灌注導致的細胞凋亡、壞死、功能下降等病程的發生發展，能促發各種炎性反應介質基因的轉錄激活〔22〕。在大鼠局灶性腦缺血模型中，缺血組織中NF-κB表達增強〔23〕，啟動IL-1、IL-6和TNF-α等炎性因子的轉錄，促進白細胞黏附、滲出與聚集。這些炎性因子又可作為NF-κB的激活劑，反過來激活NF-κB〔24〕。本研究結果表明腦缺血再灌注后NF-κB被激活，TMP可以抑制NF-κB 活化，降低炎癥級聯損傷，減輕CIRI。miRNAs與IS病理生理過程關系緊密，我們前期研究發現急性IS患者血清中存在差異的miRNAs，這些miRNAs在CIRI中發揮重要的角色〔7,25,26〕，其中表達變化較顯著的miR-199a-5p引起極大關注。 據報道，miR-199a-5p參與多種細胞進程，包括細胞分化和增殖、腫瘤發生、血管生成和自噬〔27～30〕等。尤為重要的是，miR-199a-5p調控多種細胞的凋亡和存活〔10,31,32〕。而且，miR-199a-5p主要表達在海馬組織中，可促進癲癇中神經細胞的凋亡。也有研究者認為，miR-199a-5p可參與免疫應答〔33,34〕。本文發現MCAO大鼠腦皮質中miR-199a-5p高表達，而且，TMP治療后可以降低miR-199a-5p的表達水平。推測TMP可能通過抑制miR-199a-5p的表達、降低神經細胞凋亡以及炎癥的產生，從而減輕CIRI。

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〔2016-05-11修回〕

(編輯 徐 杰)

Tetramethylpyrazine inhibits cerebral ischemia/reperfusion injury in rats by modulation of miR-199a-5p,apoptosis,and inflammation

LI Peng-Fei,SHEN Mei-Hong,WU Jin-Ping,etal.

Department of Clinical Laboratory,Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu,China

Objective To observe the inhibitory effects of tetramethylpyrazine (TMP) on cerebral ischemia and reperfusion injury (CIRI) and further explore the underling molecular mechanisms.Methods Health adult male Sprague-Dawley(SD) rats were subjected to transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO),and assigned into sham,model and TMP groups(n=20).TMP was administered via intraperitoneal injection (20 mg/kg) at the beginning of reperfusion after 2 h ischemia.After 24 h MCAO,the neurological function scores were evaluated.HE staining was used to evaluate the cerebral tissue morphology.qRT-polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expressions of miR-199a-5p,Bax,Bcl-2,TNF-α,IL-1β,and IL-6 mRNA in infarction cortex.Furthermore,enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the content of TNF-α,IL-6,IL-1β in rats′ peripheral blood.Animals were euthanized for immunohistochemical labeling to measure NF-κB p65 and NF-κB p-p65 levels in the infarction area.Results TMP significantly improved neurological function at 24 h after ischemia(P<0.05),decreased brain water content(P<0.05),reduced cerebral infarction volume(P<0.01).The damage of nerve cells in TMP group was improved significantly.The expressions of miR-199a-5p,Bax,TNF-α,IL-1β,and IL-6 mRNA were significantly increased in the brain of MCAO rats and Bcl-2 mRNA was markedly decreased.However,TMP markedly decreased the expressions of miR-199a-5p,Bax,TNF-α,IL-1β,and IL-6 mRNA and increased the expression of Bcl-2 mRNA in cortex.TMP also significantly reduced TNF-α,IL-1β,and IL-6 contents in serum of rats.In addition,IHC showed that TMP significantly decreased the expression of NF-κB p-p65(P<0.05).Conclusions The neuroprotective effect of TMP may be mediated at least by a portion of the inhibition of miR-199a-5p,followed by the inhibition of apoptosis,the reduction of proinflammatory cytokines,decrease the activation of NF-κB.

Tetramethylpyrazine;Cerebral ischemia and reperfusion injury;Apoptosis;Inflammation

國家自然科學基金資助課題(81403136,81373748,81171659,11574156)

1 南京中醫藥大學第二臨床學院 2 南京中醫藥大學基礎醫學院

張春兵(1969-)，男，副教授，主任技師，碩士生導師，主要從事中醫藥治療腦卒中的分子機制研究。

李鵬飛(1984-)，男，博士，主要從事腦卒中的分子診斷與治療基礎研究。

R743.31

A

1005-9202(2017)07-1561-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.001