蛋白磷酸酶2A Cα在昆蟲桿狀病毒中的表達及活性

渠 靜 鄭 媛 任曉曦 鄭 焱 楊 慧 張建亮

(首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系 北京腦重大疾病研究院教育部神經變性病重點實驗室，北京 100069)

蛋白磷酸酶2A Cα在昆蟲桿狀病毒中的表達及活性

渠 靜 鄭 媛 任曉曦 鄭 焱 楊 慧 張建亮

(首都醫科大學基礎醫學院神經生物學系 北京腦重大疾病研究院教育部神經變性病重點實驗室，北京 100069)

目的 利用昆蟲桿狀病毒系統表達蛋白磷酸酶(PP)2A Cα亞基并進行活性分析。方法 先將PP2A Cα構建進入昆蟲桿狀病毒表達載體，然后將其轉染到昆蟲細胞Sf9中并進行蛋白表達，最后檢測PP2A Cα的功能。結果 Western印跡結果表明PP2A Cα蛋白已經在昆蟲細胞成功表達;PP2A活性檢測和GST pull-down實驗結果表明PP2A Cα蛋白既有生物學功能，又有結構學功能。結論 昆蟲桿狀病毒載體系統可以成功表達有活性的PP2A Cα蛋白。

昆蟲桿狀病毒；蛋白磷酸酶2A

蛋白磷酸酶(PP)2A參與DNA復制、RNA剪接、基因表達、細胞代謝、分化及凋亡等活動過程，并且與老年疾病的發生發展有著密切聯系〔1，2〕。在帕金森病(PD)中，α-突觸核蛋白(α-Syn)可以使PP2A活性上調，從而使酪氨酸羥化酶(TH)去磷酸化，抑制TH活性，進而抑制多巴胺的生物合成〔3〕。在阿爾茨海默病(AD)中，PP2A活性降低，抑制tau去磷酸化，使tau蛋白過度磷酸化，進而形成神經元纖維纏結〔4〕；PP2A活性降低也會增加β淀粉樣蛋白(Aβ)生成〔5〕。因此，PP2A已成為老年疾病研究的焦點之一。PP2A由結構亞基-A和催化亞基-C形成核心酶，然后再和調節亞基-B組成全酶；其中C亞基有α和β兩種異構體，它在PP2A活性的調節中起著極其重要的作用。但是目前，PP2A確切的調節機制還不十分清楚。昆蟲桿狀病毒表達系統是近年來備受青睞的真核表達系統，利用桿狀病毒作為外源基因的載體，通過感染昆蟲細胞來表達外源蛋白，具有安全性好、蛋白表達量高、可以同時表達多個基因等優點〔6〕。本研究利用昆蟲桿狀病毒表達系統，在昆蟲細胞內表達PP2A Cα亞基，從而得到PP2A Cα蛋白，進一步實驗證明其結構完整、活性穩定。

1 材料和方法

1.1 材料 昆蟲細胞Sf9，DH10Bac大腸桿菌細胞，pFastBacTM質粒購自Invitrogen公司；Sf-900 Ⅱ無血清培養基購自美國Gibco公司；聚醚酰亞胺購自美國Sigma公司；PP2A活性比色法定量檢測試劑盒購自Genmed公司；His抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染 昆蟲細胞Sf9采用SF-900Ⅱ無血清的培養基，置于27℃的搖床上進行懸浮培養。Bacmid用聚醚酰亞胺(PEI)轉染到Sf9細胞中。

1.2.2 重組質粒的構建 用限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ將PP2A Cα基因從質粒pcDNA3.1中切出，亞克隆到質粒pFastBacTM的相應酶切位點，得到質粒pFastBac-PP2A Cα(圖1)，經過酶切鑒定以及測序進行確認。

1.2.3 重組昆蟲桿狀病毒的構建 將構建好的pFastBac-PP2A Cα轉化到大腸桿菌DH10Bac感受態細胞，在含有卡那霉素、慶大霉素、四環素和X-gal的固體LB培養基上培養，進行藍白斑篩選。將白色的單菌斑進行培養，抽提得到重組bacmid，然后通過PCR進行鑒定。用脂質介導法將bacmid轉染到昆蟲細胞Sf9中，72 h后得到培養基上清，即為第1代重組昆蟲桿狀病毒。加入第1代重組昆蟲桿狀病毒感染正常的Sf9細胞，擴增依次得到第2代昆蟲桿狀病毒。

A：pFastBac載體以及PP2A Cα插入片段的示意圖;B：pFastBac-PP2A Cα的酶切鑒定圖；1:DNA ladder；2和3:pFastBac-PP2A Cα的酶切圖(pFastBac:4 800 bp;PP2A Cα:900 bp)圖1 pFastBac-PP2A Cα的質粒構建以及酶切鑒定圖

1.2.4 重組蛋白的表達與檢測 取第2代重組昆蟲桿狀病毒加入到正常的Sf9細胞中進行蛋白表達。3 d后收取細胞,離心得到細胞沉淀，提取蛋白質。提取的蛋白質用于SDS-PAGE和Western印跡檢測。按照每個孔道2 μg 蛋白上樣，經過15%的SDS-PAGE分離蛋白質，半干法將蛋白質轉至PVDF膜。PVDF膜用5%(體積分數)的脫脂牛奶室溫封閉1 h，與鼠抗人單克隆抗His抗體(1∶2 000)于室溫反應2 h，然后與抗鼠熒光二抗(1∶10 000)于室溫反應1 h，用Odyssey Infrared成像系統檢測。

1.2.5 PP2A活性檢測 根據文獻〔7,8〕，參照Genmed試劑盒提供的使用說明書檢測PP2A活性。

1.2.6 GST pull-down實驗 將含有GST標簽的α-Syn蛋白與GST珠子在4℃結合1 h，然后加入提取的PP2A Cα蛋白，在4℃結合3 h，500 r/min離心5 min；棄掉上清，然后加入400 μl 0.1 mol/L的PBS洗滌，500 r/min離心5 min；重復洗10次，棄掉上清，加入10 μl的上樣緩沖液，95℃變性10 min；吸取上清用于Western印跡分析。

1.3 統計學方法 應用Prism6.0軟件行多因素方差分析。

2 結 果

2.1 PP2A Cα基因擴增與克隆 將PP2A Cα基因克隆到載體pFastBac上(圖1A為示意圖)，使用EcoRⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，結果表明PP2A Cα基因克隆已成功克隆到pFastBac上(圖1B)。經測序進一步鑒定，結果與預期設計一致。

2.2 重組桿狀病毒的克隆篩選 重組bacmid轉化體的菌落應呈白色，而非重組bacmid轉化體的菌落應為藍色(圖2)。挑取白色的單菌斑進行培養，抽提得到重組桿狀病毒基因組DNA。以提取的bacmid為模板，用通用引物M13進行PCR鑒定，擴增結果見圖3。重組的PP2A Cα bacmid大小應為3 200 bp，而非重組的bacmid為300 bp。筆者選取bacmid 2和3進行后面的實驗。

白色的單菌斑應為PP2A Cα bacmid，藍色的應為空載bacmid圖2 藍白斑篩選重組桿狀病毒

1:DNA ladder;2和3:bacmid of PP2A Cα(3 200 bp);4:control bacmid (300 bp)圖3 重組桿狀病毒PCR鑒定

2.3 重組蛋白的表達 SDS-PAGE檢測結果顯示，在分子量為36 kD處有條帶。為了進一步檢測目的基因表達，使用Western印跡檢測，結果顯示在分子量為36 kD處的確有目的基因表達蛋白,表明PP2A Cα蛋白表達成功。見圖4。

A：SDS-PAGE檢測PP2A Cα蛋白水平；B：Western印跡檢測PP2A Cα蛋白水平圖4 重組PP2A Cα蛋白在昆蟲細胞Sf9中的表達

2.4 PP2A Cα的功能鑒定 表達的PP2A Cα蛋白活性是對照組的4倍，表明從細胞中表達的PP2A Cα有生物學活性(圖5A)。

GST pull-down實驗結果顯示(圖5B)，PP2A Cα可以與α-Syn相互作用。以上結果表明，本研究提取的PP2A Cα既有生物學活性，又有結構學功能。

圖5 PP2A Cα蛋白的活性分析

3 討 論

PP2A是一個重要的絲/蘇氨酸殘基蛋白磷酸酶，可以使許多病理性蛋白去磷酸化，包括與PD相關的α-Syn蛋白、酪氨酸羥化酶、與AD相關的tau蛋白等，因此參與了老年疾病的發生發展過程〔9～15〕。為了在體內體外實驗中探索PP2A功能,有必要建立一種高效的PP2A Cα重組蛋白表達體系。常見的蛋白表達系統包括原核和真核表達系統。原核表達系統最常見的是大腸桿菌表達系統，但該系統會產生包涵體，而且不能產生一些翻譯后修飾，這些都不利于重組蛋白保持天然的結構和功能；而真核表達系統可以表達具有天然結構和功能的蛋白，是獲得重組蛋白的良好途徑。常見真核表達系統包括酵母表達系統、昆蟲細胞表達系統及哺乳動物表達系統。其中昆蟲細胞表達系統是目前備受人們推崇的真核表達系統，該系統主要是利用桿狀病毒作為外源基因的載體通過感染昆蟲細胞來表達外源蛋白，具有很多優點，如安全性好、蛋白表達量高、可以同時表達多個基因等。

首先，筆者利用昆蟲桿狀病毒表達系統，成功構建了PP2A Cα的重組桿狀病毒，并轉染到昆蟲細胞Sf9中，SDS-PAGE和Western印跡檢測結果顯示有大量的PP2A Cα蛋白表達；之后，筆者使用活性檢測試劑盒檢測到了該蛋白活性高于對照組4倍，表明從該體系中表達的PP2A Cα不但表達量高，而且還具有良好的生物學活性。

1 Xing Y,Li Z,Chen Y,etal.Structural mechanism of demethylation and inactivation of protein phosphatase 2A〔J〕.Cell,2008;133(1):154-63.

2 Xing Y,Xu Y,Chen Y,etal.Structure of protein phosphatase 2A core enzyme bound to tumor-inducing toxins〔J〕.Cell,2006;127(2):341-53.

3 Peng X,Tehranian R,Dietrich P,etal.Alpha-synuclein activation of protein phosphatase 2A reduces tyrosine hydroxylase phosphorylation in dopaminergic cells〔J〕.J Cell Sci,2005;118(Pt 15):3523-30.

4 Yang CC,Kuai XX,Gao WB,etal.Morroniside-induced PP2A activation antagonizes Tau hyperphosphorylation in a cellular model of neurodegeneration〔J〕.J Alzheimers Dis,2016;51(1):33-44.

5 李雪蓮，楊翠翠，張 蘭.蛋白磷酸酶2A活性調節機制及其在阿爾茨海默病中的作用〔J〕.國際藥學研究雜志,2016；43(1):39-43.

6 陳曉娟，閆少春，邵 國.蛋白表達系統的研究進展〔J〕.包頭醫學院學報,2014；30(3):142-3.

7 Yang W,Wang X,Duan C,etal.Alpha-synuclein overexpression increases phospho-protein phosphatase 2A levels via formation of calmodulin/Src complex〔J〕.Neurochem Int,2013;63(3):180-94.

8 Wang Y,Liu J,Chen M,etal.The novel mechanism of rotenone-induced alpha-synuclein phosphorylation via reduced protein phosphatase 2A activity〔J〕.Int J Biochem Cell Biol,2016;75(1):34-44.

9 王 雪，申甲梅，高 歌，等.PINK1減輕α-突觸核蛋白引起的線粒體損傷〔J〕.首都醫科大學學報,2016；37(1):70-5.

10 魯玲玲，施予晴，魏雨菲，等.帕金森病相關基因α-突觸核蛋白和PINK1對Nurr1的調節作用〔J〕.首都醫科大學學報,2015；36(6):895-901.

11 Spillantini MG,Schmidt ML,Lee VM,etal.Alpha-synuclein in Lewy bodies〔J〕.Nature,1997;388(6645):839-40.

12 Chang C,Lang H,Geng N,etal.Exosomes of BV-2 cells induced by alpha-synuclein:important mediator of neurodegeneration in PD〔J〕.Neurosci Lett,2013;548:190-5.

13 Lou H,Montoya SE,Alerte TN,etal.Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo〔J〕.J Biol Chem,2010;285(23):17648-61.

14 Anderson JP,Walker DE,Goldstein JM,etal.Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease〔J〕.J Biol Chem,2006;281(40):29739-52.

15 Martin L,Latypova X,Wilson CM,etal.Tau protein phosphatases in Alzheimer′s disease:the leading role of PP2A〔J〕.Ageing Res Rev,2013;12(1):39-49.

〔2016-11-01修回〕

(編輯 曲 莉)

Expression of protein phosphatase 2A Cα by the insect baculovirus and its activity analysis

QU Jing, ZHENG Yuan, REN Xiao-Xi,etal.

Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Center for Parkinson′s Disease, Beijing Institute for Brain Disorder, Key Laboratory for Neurodegenerative Disease of Ministry of Education, Beijing 100069, China

Objective To construct the recombinant baculovirusof protein phosphatase 2A(PP2A)Cα and express the PP2A Cα protein in insect cells.Methods Firstly,the gene of PP2A Cα was cloned into pFastBac and transpositioned into the genome of insect baculovirus.Then, the PP2A Cα protein was expressed in the insect Sf9 cells by the recombinant baculovirus.Finally, PP2A Cα activity was assayed.Results The protein of PP2A Cα was successfully expressed in the insect cells and it showed its biological activity.Conclusions The insect baculovirus could be used to express the PP2A Cα protein.

Insect baculovirus;Protein phosphatase 2A

國家自然科學基金(31271136,31571202)；北京市屬高等學校青年拔尖人才培養計劃(CIT&TCD201504087)；北京市教委科技計劃(KZ201210025020)

張建亮(1976-)，男，副教授，主要從事帕金森病相關蛋白結構功能關系的研究。

渠 靜(1990-)，女，在讀碩士，主要從事帕金森病相關蛋白結構功能關系的研究。

R816

A

1005-9202(2017)07-1571-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.004