大鼠結(jié)膜杯狀細胞的體外培養(yǎng)及鑒定

何 敏 趙長青 武耀紅 秦維山 杜玲珍

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，山西 太原 030001)

大鼠結(jié)膜杯狀細胞的體外培養(yǎng)及鑒定

何 敏 趙長青1武耀紅 秦維山 杜玲珍

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院眼科，山西 太原 030001)

目的 體外分離、培養(yǎng)大鼠結(jié)膜杯狀細胞，觀察其形態(tài)、結(jié)構(gòu)等生物學(xué)特征。方法 取大鼠穹隆部結(jié)膜，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中行組織塊培養(yǎng)，5～7 d后酶消化法傳代。觀察原代及傳代細胞的形態(tài)及生長情況，并應(yīng)用特殊免疫組化染色方法分別對原代、傳代培養(yǎng)的杯狀細胞進行鑒定，用ImageJ軟件計算細胞純度。結(jié)果 倒置相差顯微鏡下可見杯狀細胞呈鵝卵石樣，5～7 d在組織塊周圍形成環(huán)狀結(jié)節(jié)。免疫組化結(jié)果顯示，培養(yǎng)的原代細胞角蛋白(CK)4染色陰性，CK7染色陽性，且CK7陽性細胞數(shù)占(97.3±2.0)%。傳代杯狀細胞中，絕大多數(shù)凝集素UEA-I染色為陽性，陽性細胞占(91.2±2.7)%。結(jié)論 大鼠穹窿部結(jié)膜可以成功培養(yǎng)出杯狀細胞，傳代細胞仍保持原代細胞特性，且純度較高。

結(jié)膜杯狀細胞；細胞培養(yǎng)

結(jié)膜上皮是構(gòu)成眼表的重要結(jié)構(gòu)，它不僅是眼表抵御外界環(huán)境干擾的一道屏障，而且對于維持眼表的健康、維持視覺質(zhì)量都起到重要作用。結(jié)膜上皮由復(fù)層鱗狀上皮細胞和杯狀細胞組成，它們除了可以分泌水和電解質(zhì)，還分泌黏蛋白。其中杯狀細胞分泌的大分子糖蛋白是淚膜的主要成分，也是構(gòu)成淚液中可溶性黏液的主要部分，對于維持眼表的健康意義重大。越來越多的實驗證明，杯狀細胞不僅參與分泌黏蛋白，而且黏蛋白的分泌受到組胺、白介素、上皮生長因子等調(diào)節(jié)〔1～3〕，它已被認為是一種免疫細胞，參與了眼表的免疫反應(yīng)〔4〕。因此對于杯狀細胞的研究已經(jīng)成為近年來研究的熱點。

對于結(jié)膜杯狀細胞體外培養(yǎng)的研究國外學(xué)者已有較多報道〔5～7〕，但國內(nèi)只有較少的學(xué)者對人和兔的結(jié)膜杯狀細胞進行了研究〔8，9〕。因為人的正常結(jié)膜組織來源有限，因此本實驗通過對大鼠的結(jié)膜杯狀細胞進行分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定，為進一步深入研究杯狀細胞的病理生理特性提供可靠的細胞模型。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，出生后4～6 w，體重125～150 g，山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物及所有實驗得到了山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基來源于美國BioWhittaker公司，抗細胞角蛋白(CK)7鼠抗體來源于美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，抗細胞CK4兔抗體來源于美國Abcam生物技術(shù)公司，交聯(lián)FITC的凝集素UEA-I來源于美國Pierce公司，胎牛血清來源于美國Hyclone公司。Cy3抗鼠IgG，Cy2抗兔IgG來源于美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)膜杯狀細胞的分離、培養(yǎng)及傳代 大鼠于CO2室箱內(nèi)約1～2 min后致死，斷頭，從雙眼取穹窿部結(jié)膜。將取下的組織放于盛有完全RPMI 1 640 培養(yǎng)基(包含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺，100 μg/ml青鏈霉素，10 mmol/L Hepes緩沖液，1 mmol/L丙酮酸鈉，1%100×非必需氨基酸混合物)的塑料器皿中，于顯微鏡下將結(jié)膜下脂肪及筋膜組織剔除，并將其切割成1 mm×1 mm×1 mm大小組織塊，更換培養(yǎng)液后備用。取六孔板，每孔加0.5 ml的完全RPMI 1 640培養(yǎng)基。將分割好的結(jié)膜組織塊分散放于培養(yǎng)皿底部，每孔約8～10塊組織，然后放于37℃含95% O2、5% CO2的孵箱內(nèi)。48 h后，小心補充0.5 ml的培養(yǎng)基，防止組織塊松動、漂浮。3 d后全量換液。

1.3.2 結(jié)膜杯狀細胞的傳代 5～7 d后，取出培養(yǎng)皿，在顯微鏡下用標記筆標出組織塊周圍的杯狀細胞，并用刮板將成纖維細胞刮除。吸出培養(yǎng)皿底部的組織塊及培養(yǎng)液，用PBS液清洗3次，每次約加入1 ml。然后室溫下加入1 ml Versene液8～10 min，以分散細胞。吸出Versene，每孔加入0.25 mol/L的胰蛋白酶1～1.5 ml，在37℃孵育箱內(nèi)放置約10 min。然后每孔加入完全培養(yǎng)液 1.5 ml，終止消化。用吸管反復(fù)輕柔吹打1～2 min。將混合液吸入50 ml離心管，用離心機1 000 r/min，離心10 min，吸除上清液，加入完全RPMI 1640培養(yǎng)液，反復(fù)吹打5 min，重懸細胞，然后接種于24孔或6孔板，每孔約0.5 ml或者1.0 ml，接種密度為每孔(5～10)×104。初始換液24～48 h，以后2～3 d換液一次。待細胞鋪滿80%后使用。

1.3.3 大鼠結(jié)膜杯狀細胞的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)檢查 在光學(xué)顯微鏡下觀察原代及傳代杯狀細胞的形態(tài)、大小、生長情況并進行拍照。

1.3.3.2 原代杯狀細胞鑒定及純度分析 將大鼠結(jié)膜上皮組織塊直接種植在盛有載玻片的培養(yǎng)皿上原代培養(yǎng)，7 d后吸出培養(yǎng)液，用1×PBS液清洗1次，加入1 ml甲醇固定15～30 min，然后吸出甲醇，用1×PBS液漂洗3次。再加入2 ml 1×PBS液放于4℃冰箱保存待用。將固定好的載玻片取出，放于固定架上，浸于盛有1×PBS液的燒杯中，于搖床上清洗5 min。將載玻片放入 2%BSA 封閉液中，在搖床上輕搖30 min～2 h。 取出載玻片，將1∶100的含CK7 抗體和CK4抗體的0.2% BSA稀釋液浸滿載玻片表面，放置于濕盒內(nèi)于4℃冰箱孵育過夜。1∶100的含正常鼠的IgG抗體作為陰性對照組。取出載玻片，在搖床上用1×PBS液漂洗3次，每次10 min。制備新的BSA稀釋液，室溫下加入1∶300的Cy3和Cy2混合液孵育1 h(避光)。再用1×PBS液漂洗3次，用含有DAPI的封片劑封片。在暗箱內(nèi)風(fēng)干過夜，次日在熒光顯微鏡下觀察。選取組織塊和環(huán)狀細胞結(jié)節(jié)外圍之間3、6、9、12點鐘的等距位置，用ImageJ 1.48v軟件計算DAPI核染色陽性的總細胞數(shù)及CK7 和CK4 陽性細胞，并計算各自百分比。

1.3.3.3 傳代杯狀細胞的鑒定及純度分析 將消化后的細胞接種在盛有載玻片的培養(yǎng)皿上，然后固定(方法同上)。將1∶100的含CK7 抗體的稀釋液浸滿載玻片表面，1∶100的含正常鼠的IgG抗體作為陰性對照組，放置于濕盒內(nèi)于4℃冰箱孵育過夜。在1 ml稀釋液中加入2 μl UEA-I(與FITC熒光素共軛)抗體。600 μl上述UEA-I溶液加入2 μl Cy3(2抗)制備成Cy3混合液。孵育1 h(避光)。封片后熒光顯微鏡下觀察。隨機選取4個鏡下視野，用ImageJ 1.48v軟件計算DAPI核染色陽性的總細胞數(shù)、UEA-I 陽性細胞及CK7陽性細胞，并計算各自所占百分比。

2 結(jié) 果

2.1 杯狀細胞分離、生長及形態(tài) 在細胞培養(yǎng)的24 h內(nèi)，組織塊周邊可見有貼附的細胞。36～48 h后，鵝卵石樣的杯狀細胞清晰可見。在原代培養(yǎng)的5～7 d，杯狀細胞圍繞在組織塊周圍形成環(huán)形結(jié)節(jié)(圖1)。但并不是每一個組織塊都形成環(huán)形結(jié)節(jié)，在5 d左右的時間將未生長出細胞的結(jié)節(jié)去除，此外有些組織塊在生長至3～5 d時在環(huán)形結(jié)節(jié)的外圍可見有梭形的成纖維細胞。為了使細胞得以純化，這些成纖維細胞在傳代時需要被仔細刮除。杯狀細胞呈鵝卵石樣，大小相近，在顯微鏡下可見其表面有小滴，這是其分泌的黏蛋白。隨著杯狀細胞的增生，蛋白小滴也增多。當細胞增生到一定程度后，即原代培養(yǎng)5～7 d后，用酶消化法傳代，傳代的細胞在形態(tài)上與原代相似。

圖1 大鼠穹隆結(jié)膜組織塊在含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d后形成的環(huán)狀結(jié)節(jié)(×40)

2.2 原代杯狀細胞CK7和CK4鑒定及純度分析 培養(yǎng)的原代細胞CK4陰性、CK7染色陽性，證明培養(yǎng)的細胞為杯狀細胞(圖2)。對3個不同來源的結(jié)膜組織的標本進行染色計算，CK7陽性細胞占(97.3±2.0)%，CK4陽性細胞占(0.1±0.1)%。在正常老鼠IgG 陰性對照組中未見熒光染色陽性。

2.3 傳代細胞UEA-I和CK7鑒定及純度分析 對3個不同來源的結(jié)膜組織的標本進行染色計算，傳代培養(yǎng)的一代杯狀細胞中UEA-I染色陽性細胞占(91.2±2.7)%，CK7染色陽性細胞占(92.4±3.2)%，進一步證明傳代后的杯狀細胞仍保留有原來的功能和特性，且具有較高純度。見圖3。

A.培養(yǎng)的細胞核被DAPI染為藍色;B.CK4 染色，陽性細胞胞漿中間絲染為綠色，但培養(yǎng)的細胞染色為陰性;C.CK7 染色，陽性細胞胞漿中間絲染為紅色;D.ABC融合后的圖像圖2 原代培養(yǎng)結(jié)膜杯狀細胞的鑒定(×200)

圖3 一代結(jié)膜杯狀細胞的鑒定(×400)

3 討 論

隨著環(huán)境及生活方式的改變，干眼、過敏性結(jié)膜炎等眼表疾病也越來越受到人們關(guān)注。其中，杯狀細胞在維持眼表的完整性及在眼表疾病免疫調(diào)節(jié)中的作用也開始被人們認識。為了進一步研究杯狀細胞的結(jié)構(gòu)、功能以及它對于環(huán)境、物理、化學(xué)等因素影響的變化，需要我們建立一個優(yōu)質(zhì)的體外細胞模型。本實驗研究取材于大鼠的上下穹窿部結(jié)膜，相對于球結(jié)膜和瞼結(jié)膜，穹窿部結(jié)膜的杯狀細胞增生能力更高〔10〕。使用加入L-谷氨酰胺、抗生素、小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基后，大鼠結(jié)膜的杯狀細胞可以在24 h內(nèi)就從穹窿結(jié)膜組織中分離出來，并增生形成環(huán)狀結(jié)節(jié)。因為杯狀細胞分泌黏蛋白，使得杯狀細胞與培養(yǎng)皿黏附緊密，因此在傳代時需要加入乙二胺四乙酸(Versense)，使得貼服的細胞更容易離散。培養(yǎng)5～7 d時有些組織塊的環(huán)形細胞結(jié)節(jié)周邊可見有梭形的成纖維細胞增生，因此在傳代過程中，要仔細刮除這些成纖維細胞，使細胞得以純化，實驗證明傳代后的細胞仍然完整保留有杯狀細胞標記和功能活動，且純度較高。

CK是一種中間絲，它是一類存在于上皮細胞中的結(jié)構(gòu)蛋白，具有極高的保守性和組織分化特異性，與上皮細胞的增殖分化密切相關(guān)。其中CK7是分泌性上皮細胞的標志物，不僅是一些上皮惡性腫瘤細胞的標記物，而且在正常組織中也是杯狀細胞的特異標志〔11〕。CK4是復(fù)層鱗狀上皮細胞的標志物，見于舌、會厭及食道上皮組織，在結(jié)膜組織中，它是非杯狀細胞的復(fù)層鱗狀上皮細胞的特異標志〔12〕。本實驗通過免疫組化染色，證明所培養(yǎng)細胞是結(jié)膜杯狀細胞。

凝集素UEA-I是一種高分子量的糖復(fù)合物，它是杯狀細胞分泌產(chǎn)物中糖蛋白上的L-巖藻糖，存在于細胞體內(nèi)，染色陽性表現(xiàn)為繞核分布的胞質(zhì)著色，呈囊泡狀〔13〕。我們發(fā)現(xiàn)，傳代的杯狀細胞的UEA-I及CK7陽性率均在90%以上，且形態(tài)和原代相似，進一步表明經(jīng)過酶消化法傳代的杯狀細胞仍具有原代杯狀細胞的形態(tài)和特性，一般傳3～5代杯狀細胞形態(tài)及功能未發(fā)生改變，一代的杯狀細胞性狀更穩(wěn)定，常用于體外實驗研究〔5〕，可以作為細胞模型用于進行體外生物學(xué)研究。

本研究表明，選取大鼠的穹窿部結(jié)膜，可以分離和培養(yǎng)出結(jié)膜杯狀細胞，且消化傳代后的細胞仍然完整保留有杯狀細胞的標記和功能，且純度較高，可以為今后進一步研究杯狀細胞相關(guān)的眼表疾病提供有效的細胞模型。

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〔2016-07-15修回〕

(編輯 徐 杰)

山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(2016-062)

1 山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科

趙長青(1961-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士，主要從事變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病機制研究。

何 敏(1975-)，女，碩士，講師，主要從事眼表疾病及眼免疫研究。

R33

A

1005-9202(2017)07-1585-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.009