微小RNA-140-5p在老年下咽癌組織中的表達(dá)及對(duì)下咽癌細(xì)胞株FaDu遷移、侵襲力的影響

陳 彤 楊小龍 楊智玲

(甘肅省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

微小RNA-140-5p在老年下咽癌組織中的表達(dá)及對(duì)下咽癌細(xì)胞株FaDu遷移、侵襲力的影響

陳 彤 楊小龍 楊智玲

(甘肅省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討微小RNA-140-5p(MiR-140-5p)影響去整合素金屬蛋白酶(ADAM)10表達(dá)對(duì)老年下咽癌組織和細(xì)胞的作用。方法 實(shí)時(shí)熒光定量RCR檢測(cè)MiR-140-5p和ADAM10在41例老年下咽癌患者腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)；利用轉(zhuǎn)染技術(shù)分別上調(diào)MiR-140-5p表達(dá)，下調(diào)MiR-140-5p和ADAM10表達(dá)；采用Transwell細(xì)胞侵襲/遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MiR-140-5p上調(diào)、MiR-140-5p下調(diào)、ADAM10下調(diào)對(duì)FaDu細(xì)胞遷移、侵襲的影響；Western印跡檢測(cè)41對(duì)組織標(biāo)本和FaDu細(xì)胞的ADAM10蛋白表達(dá)。結(jié)果 MiR-140-5p在下咽癌組織中明顯下調(diào)，ADAM10 mRNA和蛋白在下咽癌組織中均明顯上調(diào)。實(shí)驗(yàn)組FaDu細(xì)胞干擾ADAM10表達(dá)后，ADAM10表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中MiR-140-5p上調(diào)組每視野下平均遷移細(xì)胞數(shù)均明顯低于對(duì)照組，MiR-140-5p下調(diào)組均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。ADAM10下調(diào)可逆轉(zhuǎn)MiR-140-5p下調(diào)對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的促進(jìn)作用。Western印跡顯示，MiR-140-5p表達(dá)上調(diào)后，實(shí)驗(yàn)組ADAM10蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組；MiR-140-5p表達(dá)下調(diào)后，實(shí)驗(yàn)組ADAM10蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組。結(jié)論 MiR-140-5p在老年下咽癌組織中低表達(dá)，ADAM10高表達(dá)。MiR-140-5p抑制下咽癌細(xì)胞遷移、侵襲力可通過下調(diào)ADAM10蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)，MiR-140-5p可作為下咽癌治療的新靶點(diǎn)。

下咽癌；微小RNAs；去整合素金屬蛋白酶10

目前高齡下咽癌患者逐漸增多，作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中預(yù)后最差的惡性腫瘤，患者5年生存率僅為25%～30%〔1〕。高齡患者多合并循環(huán)、呼吸系統(tǒng)疾病，治療較為困難。因此，深入研究下咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，探索相關(guān)作用靶點(diǎn)，對(duì)下咽癌的防治具有重要意義。微小RNA(miRNA)可在腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲過程中發(fā)揮致癌或抑癌基因的作用。MiR-140-5p是miRNA家族中一員，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MiR-140-5p在肝癌、舌癌組織中表達(dá)下調(diào)，扮演抑癌基因的角色〔2〕，但其在下咽癌中的作用機(jī)制仍未明確。去整合素金屬蛋白酶(ADAM)10作為一種跨膜蛋白，在多個(gè)腫瘤組織中存在高表達(dá)，且與腫瘤的增殖、遷移明顯相關(guān)。研究顯示，MiR-140-5p可通過靶向抑制ADAM10的表達(dá)發(fā)揮抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用〔3〕，但在下咽癌中的可能調(diào)控機(jī)制鮮有報(bào)道。本次研究檢測(cè)MiR-140-5p和ADAM10在老年下咽癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步以下咽癌細(xì)胞株FaDu為材料，探究MiR-140-5p對(duì)FaDu細(xì)胞遷移、侵襲力的影響，并分析其與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)ADAM10的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014年6月至2015年12月在本院耳鼻喉頭頸外科行手術(shù)治療的老年原發(fā)性下咽鱗狀細(xì)胞癌患者41例，均未接受放化療，病灶無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬簽署知情同意書。男38例，女3例，年齡60～75歲；原發(fā)部位梨狀窩癌27例，環(huán)后癌10例，下咽后壁癌4例。每位患者均取下咽原發(fā)腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織(與腫瘤切緣距離>0.5 cm，病理檢查顯示無殘余癌細(xì)胞)。人下咽癌細(xì)胞株FaDu購(gòu)于南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000(南京森貝伽生物科技有限公司)；MiR-140-5p過表達(dá)載體、si-ADAM10構(gòu)建與測(cè)序(南京科維思生物科技有限公司)；MiR-140-5p引物、qRT-PCR試劑盒、Transwell小室(美國(guó)Genecopoeia公司)；兔抗人ADAM10抗體、小鼠抗人β-actin抗體(北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。熒光顯微鏡CKX41(日本OLYMPUS)；全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Nexcelom)；Mx3005P熒光定量PCR儀(美國(guó)Agilent)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人下咽癌細(xì)胞株FaDu用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中每2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞計(jì)數(shù)后按每孔5×105接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率≥70%時(shí)開始轉(zhuǎn)染。

MiR-140-5p上調(diào)實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組：僅加入Lipofectamine?3000；②陰性對(duì)照組：加入過表達(dá)載體陰性對(duì)照組miRNA和Lipofectamine?3000；③MiR-140-5p上調(diào)組：加入has-MiR-140-5p過表達(dá)載體和Lipofectamine?3000。

MiR-140-5p下調(diào)分組：①空白對(duì)照組同上；②陰性對(duì)照組：加入陰性對(duì)照miRNA和Lipofectamine?3000；③MiR-140-5p下調(diào)實(shí)驗(yàn)組：加入MiR-140-5p inhibitor和Lipofectamine?3000；④MiR-140-5p下調(diào)和si-ADAM10共轉(zhuǎn)染組：加入MiR-140-5p inhibitor、si-ADAM10 RNA、Lipofectamine?3000。

ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)分組：①空白對(duì)照組同上；②陰性對(duì)照組：加入陰性對(duì)照siRNA和Lipofectamine?3000；③ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)組：加入si-ADAM10 RNA和Lipofectamine?3000。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量RCR Trizol法提取標(biāo)本組織和FaDu細(xì)胞中RNA，測(cè)定RNA純度，使用All-in-OneTMqPCR檢測(cè)試劑盒及Revert Aid First Strand cDNA試劑盒進(jìn)行MiR-140-5p和ADAM10的反轉(zhuǎn)錄，均在常規(guī)PCR反應(yīng)條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，MiR-140-5p以U6為內(nèi)參，ADAM10以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參。每個(gè)標(biāo)本均檢測(cè)3次，2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 Western印跡 RIPA蛋白裂解試劑盒提取標(biāo)本組織和FaDu細(xì)胞中的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。95℃變性5 min，取30 μg行PAGE，濕法轉(zhuǎn)移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，奶粉封閉后加入兔抗人ADAM10一抗(1∶1 000稀釋)和小鼠抗人β-actin一抗(1∶3 000稀釋)，4℃孵化過夜，加入二抗(1∶3 000稀釋)，化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯色，熒光圖像分析儀采集圖像。

1.3.4 Transwell細(xì)胞侵襲/遷移實(shí)驗(yàn) Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶3比例配制基質(zhì)膠，取20 μl抹于Transwell小室，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，消化各組細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，上室加入100 μl含5×104個(gè)細(xì)胞的懸液，下室加入500 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，小室放入培養(yǎng)箱中孵育24 h，用無菌棉簽去除上室中的基質(zhì)膠和殘余細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)并拍照。遷移實(shí)驗(yàn)中小室不鋪基質(zhì)膠，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MiR-140-5p、ADAM10 mRNA及蛋白在標(biāo)本組織中表達(dá) PCR檢測(cè)顯示，MiR-140-5p在下咽癌組織中表達(dá)水平為0.091±0.045，明顯低于癌旁組織中0.155±0.097，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以檢測(cè)結(jié)果的中位數(shù)為臨界值將41例下咽癌患者分為MiR-140-5p低表達(dá)組21例和高表達(dá)組20例。分析MiR-140-5p表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系顯示，MiR-140-5p表達(dá)與性別無明顯相關(guān)性，與腫瘤T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期明顯關(guān)聯(lián)(P<0.05)，見表1。PCR檢測(cè)顯示，ADAM10 mRNA在下咽癌組織中表達(dá)水平為0.088±0.051，明顯高于癌旁組織中0.046±0.023(P<0.01)。Western印跡檢測(cè)顯示，ADAM10蛋白在下咽癌組織中表達(dá)水平為0.992±0.263，明顯高于癌旁組織中0.506±0.229(P<0.01)，見圖1。

表1 臨床病理參數(shù)與MiR-140-5p表達(dá)的關(guān)系(n)

圖1 ADAM10蛋白在癌旁組織和下咽癌組織中表達(dá)情況

2.2 轉(zhuǎn)染MiR-140-5p上調(diào)、MiR-140-5p下調(diào)與ADAM10干擾后檢測(cè)has-MiR-140-5p和ADAM10的表達(dá)情況 PCR檢測(cè)顯示，MiR-140-5p上調(diào)組MiR-140-5p表達(dá)水平為0.145±0.025，明顯高于陰性對(duì)照組的0.051±0.013(P<0.05)。MiR-140-5p下調(diào)組MiR-140-5p表達(dá)水平為0.011±0.003，明顯低于陰性對(duì)照組的0.036±0.009(P<0.05)。空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)組ADAM10 mRNA表達(dá)水平為0.020±0.005，明顯低于陰性對(duì)照組的0.691±0.018(P<0.05)；進(jìn)一步行Western印跡檢測(cè)顯示，ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)水平為0.422±0.056，明顯低于空白對(duì)照組1.016±0.321和陰性對(duì)照組1.150±0.406(P<0.01)，見圖2。

圖2 ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)中各組ADAM10蛋白表達(dá)情況

A.遷移實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照組；B.遷移實(shí)驗(yàn)MiR-140-5p上調(diào)組；C.侵襲實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照組；D.侵襲實(shí)驗(yàn)MiR-140-5p上調(diào)組圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察MiR-140-5p上調(diào)對(duì)FaDu細(xì)胞遷移和侵襲力的影響(×100)

2.3 MiR-140-5p上調(diào)對(duì)FaDu細(xì)胞的影響 圖3可見，遷移實(shí)驗(yàn)中，MiR-140-5p上調(diào)組每視野下平均遷移細(xì)胞數(shù)分別為95.444±18.159，明顯低于陰性對(duì)照組的160.451±16.005(P<0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)中，MiR-140-5p上調(diào)組每視野下平均遷移細(xì)胞數(shù)分別為75.000±6.726，明顯低于陰性對(duì)照組的103.557±10.747(P<0.05)。可見上調(diào)MiR-140-5p表達(dá)后腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲力明顯降低，其在下咽癌中起到抑癌基因作用。

2.4 MiR-140-5p對(duì)FaDu細(xì)胞中ADAM10蛋白表達(dá)的影響和MiR-140-5p下調(diào)對(duì)FaDu細(xì)胞的影響及與ADAM10蛋白表達(dá)的關(guān)系 MiR-140-5p表達(dá)上調(diào)后，實(shí)驗(yàn)組的ADAM10蛋白表達(dá)水平明顯低于陰性對(duì)照組；MiR-140-5p表達(dá)下調(diào)后，實(shí)驗(yàn)組的ADAM10蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對(duì)照組。提示MiR-140-5p可抑制ADAM10蛋白表達(dá)。使用FaDu細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染MiR-140-5p inhibitor和si-ADAM10 RNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)si-ADAM10 RNA可在一定程度上逆轉(zhuǎn)MiR-140-5p下調(diào)對(duì)ADAM10蛋白的升高作用。遷移實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組、ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)組、MiR-140-5p下調(diào)組以及MiR-140-5p下調(diào)和si-ADAM10共轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為：158.442±12.585、100.005±18.458、285.441±13.775、227.795±30.259，MiR-140-5p下調(diào)實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯增加，ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組、ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)組、MiR-140-5p下調(diào)組以及MiR-140-5p下調(diào)和si-ADAM10共轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)分別為：105.910±9.446、85.444±5.139、185.561±19.569、139.665±7.139，MiR-140-5p下調(diào)實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯增加，ADAM10干擾實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)。而MiR-140-5p下調(diào)和si-ADAM10共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，ADAM10下調(diào)可逆轉(zhuǎn)MiR-140-5p對(duì)FaDu細(xì)胞遷移和侵襲的促進(jìn)作用。見圖4～圖6。

圖4 上調(diào)MiR-140-5p對(duì)ADAM10表達(dá)的影響

1.對(duì)照組；2.MiR-140-5p下調(diào)組；3.ADAM10干擾組；4.MiR-140-5p下調(diào)和si-ADAM10共轉(zhuǎn)染組圖5 下調(diào)MiR-140-5p對(duì)ADAM10表達(dá)的影響

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)MiR-140-5p表達(dá)和下調(diào)ADAM10對(duì)FaDu細(xì)胞遷移和侵襲力的影響(×100)

3 討 論

異常表達(dá)的miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，其中MiR-140-5p在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的角色，例如：MiR-140-5p在肝癌組織中明顯下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)，可明顯降低腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲力〔4〕。但目前關(guān)于MiR-140-5p對(duì)下咽癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控機(jī)制仍未見系統(tǒng)報(bào)道。本次研究顯示，MiR-140-5p在下咽癌組織中表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，并與腫瘤T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期之間存在明顯相關(guān)性。通過轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)MiR-140-5p在FaDu細(xì)胞中表達(dá)后，細(xì)胞的遷移、侵襲力明顯降低；而上調(diào)其表達(dá)，細(xì)胞遷移、侵襲力明顯增加。

ADAMs家族是Ⅰ型跨膜蛋白家族，廣泛參與腫瘤的額病理過程〔5〕。ADAM10作為ADAMs家族一員，在多種腫瘤組織中高表達(dá)。研究顯示，ADAM10在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，干擾ADAM10表達(dá)可降低其遷移和侵襲能力〔6〕。說明ADAM10在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本次研究顯示，ADAM10在下咽癌組織中高表達(dá)，但其表達(dá)水平與臨床病理特征無明顯關(guān)聯(lián)，可能與本次研究樣本量較少有關(guān)，需進(jìn)一步探討。下調(diào)FaDu細(xì)胞中ADAM10表達(dá)水平可明顯降低FaDu細(xì)胞的遷移、侵襲力，提示ADAM10作為致癌基因可影響下咽癌的發(fā)生、發(fā)展。

miRNA可調(diào)控40%以上的蛋白編碼基因，探尋靶基因有助于明確miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲中的作用機(jī)制。依據(jù)miRNA配對(duì)原則使用靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)MiR-140-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)ADAM10與腫瘤組織惡性程度明顯相關(guān)。基于上述研究結(jié)論，本次研究中將ADAM10作為MiR-140-5p的靶基因進(jìn)一步探討對(duì)老年咽癌的作用。結(jié)果顯示，上調(diào)FaDu細(xì)胞中的MiR-140-5p表達(dá)，ADAM10蛋白表達(dá)明顯降低；下調(diào)MiR-140-5p表達(dá)后ADAM10蛋白表達(dá)明顯增加；同時(shí)下調(diào)ADAM10表達(dá)可有效逆轉(zhuǎn)MiR-140-5p下調(diào)對(duì)下咽癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的增強(qiáng)作用。提示MiR-140-5p可通過下調(diào)致癌基因ADAM10來抑制下咽癌細(xì)胞的遷移、侵襲力。

1 Xia CX，Zhu Q，Cheng Y,etal.Sonographic assessment of hypopharyngeal carcinoma：preliminary study〔J〕.J Ultrasound Med，2011；30(2)：217-25.

2 LoGalbo AM，Kuik DJ，Lips P，etal.A prospective longitudinal study on endocrine dysfunction following treatment of laryngeal or hypopharyngeal carcinoma〔J〕.Oral Oncol，2013；49(9)：950-5.

3 Fukada J，Shigematsu N，Takeda A,etal.Weekly low-dose docetaxel-based chemoradiotherapy for locally advanced oropharyngeal or hypopharyngeal carcinoma：a retrospective，single-institution study 〔J〕.Int J Radiat Oncol，2010；76(2)：417-24.

4 Suzuki K，Hayashi R，Ebihara M，etal.The effectiveness of chemoradiation therapy and salvage surgery for hypopharyngeal squamous cell carcinoma〔J〕.Jap J Clin Oncol，2013；43(12)：1210-7.

5 張濛川，韓 笑，安麗萍，等.P-5m八肽對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)的抑制作用〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016；17(2)：191-5.

6 Shen C，Xiang M，Nie C，etal.CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer〔J〕.Acta Otolaryngologica，2013；133(11)：1219-26.

〔2016-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳 彤(1986-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉頭頸外科臨床研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1588-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.010