微小RNA-140-5p在老年下咽癌組織中的表達及對下咽癌細胞株FaDu遷移、侵襲力的影響

陳 彤 楊小龍 楊智玲

(甘肅省人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

微小RNA-140-5p在老年下咽癌組織中的表達及對下咽癌細胞株FaDu遷移、侵襲力的影響

陳 彤 楊小龍 楊智玲

(甘肅省人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討微小RNA-140-5p(MiR-140-5p)影響去整合素金屬蛋白酶(ADAM)10表達對老年下咽癌組織和細胞的作用。方法 實時熒光定量RCR檢測MiR-140-5p和ADAM10在41例老年下咽癌患者腫瘤組織及癌旁組織中的表達；利用轉染技術分別上調MiR-140-5p表達，下調MiR-140-5p和ADAM10表達；采用Transwell細胞侵襲/遷移實驗檢測MiR-140-5p上調、MiR-140-5p下調、ADAM10下調對FaDu細胞遷移、侵襲的影響；Western印跡檢測41對組織標本和FaDu細胞的ADAM10蛋白表達。結果 MiR-140-5p在下咽癌組織中明顯下調，ADAM10 mRNA和蛋白在下咽癌組織中均明顯上調。實驗組FaDu細胞干擾ADAM10表達后，ADAM10表達水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)。Transwell實驗顯示，遷移和侵襲實驗中MiR-140-5p上調組每視野下平均遷移細胞數均明顯低于對照組，MiR-140-5p下調組均明顯高于對照組(P<0.05)；ADAM10干擾實驗組遷移和侵襲細胞數明顯低于對照組(P<0.05)。ADAM10下調可逆轉MiR-140-5p下調對細胞遷移和侵襲能力的促進作用。Western印跡顯示，MiR-140-5p表達上調后，實驗組ADAM10蛋白表達水平明顯低于陰性對照組；MiR-140-5p表達下調后，實驗組ADAM10蛋白表達水平明顯高于陰性對照組。結論 MiR-140-5p在老年下咽癌組織中低表達，ADAM10高表達。MiR-140-5p抑制下咽癌細胞遷移、侵襲力可通過下調ADAM10蛋白表達實現，MiR-140-5p可作為下咽癌治療的新靶點。

下咽癌；微小RNAs；去整合素金屬蛋白酶10

目前高齡下咽癌患者逐漸增多，作為頭頸部鱗狀細胞癌中預后最差的惡性腫瘤，患者5年生存率僅為25%～30%〔1〕。高齡患者多合并循環、呼吸系統疾病，治療較為困難。因此，深入研究下咽癌轉移的分子機制，探索相關作用靶點，對下咽癌的防治具有重要意義。微小RNA(miRNA)可在腫瘤轉移、侵襲過程中發揮致癌或抑癌基因的作用。MiR-140-5p是miRNA家族中一員，相關研究發現，MiR-140-5p在肝癌、舌癌組織中表達下調，扮演抑癌基因的角色〔2〕，但其在下咽癌中的作用機制仍未明確。去整合素金屬蛋白酶(ADAM)10作為一種跨膜蛋白，在多個腫瘤組織中存在高表達，且與腫瘤的增殖、遷移明顯相關。研究顯示，MiR-140-5p可通過靶向抑制ADAM10的表達發揮抑制腫瘤轉移的作用〔3〕，但在下咽癌中的可能調控機制鮮有報道。本次研究檢測MiR-140-5p和ADAM10在老年下咽癌組織中的表達情況，并進一步以下咽癌細胞株FaDu為材料，探究MiR-140-5p對FaDu細胞遷移、侵襲力的影響，并分析其與預測靶點ADAM10的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014年6月至2015年12月在本院耳鼻喉頭頸外科行手術治療的老年原發性下咽鱗狀細胞癌患者41例，均未接受放化療，病灶無遠處轉移；本次研究經醫院倫理委員會批準，患者或家屬簽署知情同意書。男38例，女3例，年齡60～75歲；原發部位梨狀窩癌27例，環后癌10例，下咽后壁癌4例。每位患者均取下咽原發腫瘤組織和對應的癌旁組織(與腫瘤切緣距離>0.5 cm，病理檢查顯示無殘余癌細胞)。人下咽癌細胞株FaDu購于南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 轉染試劑Lipofectamine?3000(南京森貝伽生物科技有限公司)；MiR-140-5p過表達載體、si-ADAM10構建與測序(南京科維思生物科技有限公司)；MiR-140-5p引物、qRT-PCR試劑盒、Transwell小室(美國Genecopoeia公司)；兔抗人ADAM10抗體、小鼠抗人β-actin抗體(北京寰宇科創生物科技發展有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。熒光顯微鏡CKX41(日本OLYMPUS)；全自動細胞計數儀(美國Nexcelom)；Mx3005P熒光定量PCR儀(美國Agilent)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及轉染 人下咽癌細胞株FaDu用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在37℃、5%CO2細胞培養箱中每2～3 d傳代一次，取對數期細胞進行實驗。細胞計數后按每孔5×105接種于6孔板中，培養至細胞覆蓋率≥70%時開始轉染。

MiR-140-5p上調實驗分組：①空白對照組：僅加入Lipofectamine?3000；②陰性對照組：加入過表達載體陰性對照組miRNA和Lipofectamine?3000；③MiR-140-5p上調組：加入has-MiR-140-5p過表達載體和Lipofectamine?3000。

MiR-140-5p下調分組：①空白對照組同上；②陰性對照組：加入陰性對照miRNA和Lipofectamine?3000；③MiR-140-5p下調實驗組：加入MiR-140-5p inhibitor和Lipofectamine?3000；④MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染組：加入MiR-140-5p inhibitor、si-ADAM10 RNA、Lipofectamine?3000。

ADAM10干擾實驗分組：①空白對照組同上；②陰性對照組：加入陰性對照siRNA和Lipofectamine?3000；③ADAM10干擾實驗組：加入si-ADAM10 RNA和Lipofectamine?3000。

1.3.2 實時熒光定量RCR Trizol法提取標本組織和FaDu細胞中RNA，測定RNA純度，使用All-in-OneTMqPCR檢測試劑盒及Revert Aid First Strand cDNA試劑盒進行MiR-140-5p和ADAM10的反轉錄，均在常規PCR反應條件下進行40個循環，MiR-140-5p以U6為內參，ADAM10以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參。每個標本均檢測3次，2-△△CT法計算相對表達量。

1.3.3 Western印跡 RIPA蛋白裂解試劑盒提取標本組織和FaDu細胞中的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。95℃變性5 min，取30 μg行PAGE，濕法轉移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，奶粉封閉后加入兔抗人ADAM10一抗(1∶1 000稀釋)和小鼠抗人β-actin一抗(1∶3 000稀釋)，4℃孵化過夜，加入二抗(1∶3 000稀釋)，化學增強發光法(ECL)顯色，熒光圖像分析儀采集圖像。

1.3.4 Transwell細胞侵襲/遷移實驗 Matrigel膠與無血清DMEM培養基按1∶3比例配制基質膠，取20 μl抹于Transwell小室，細胞培養箱中孵育3 h，消化各組細胞，使用無血清培養基重懸細胞，上室加入100 μl含5×104個細胞的懸液，下室加入500 μl含10%FBS的DMEM培養液，小室放入培養箱中孵育24 h，用無菌棉簽去除上室中的基質膠和殘余細胞，光學顯微鏡下選取5個視野計數并拍照。遷移實驗中小室不鋪基質膠，其余步驟同侵襲實驗。

2 結 果

2.1 MiR-140-5p、ADAM10 mRNA及蛋白在標本組織中表達 PCR檢測顯示，MiR-140-5p在下咽癌組織中表達水平為0.091±0.045，明顯低于癌旁組織中0.155±0.097，差異有顯著統計學意義(P<0.01)。以檢測結果的中位數為臨界值將41例下咽癌患者分為MiR-140-5p低表達組21例和高表達組20例。分析MiR-140-5p表達與臨床病理特征關系顯示，MiR-140-5p表達與性別無明顯相關性，與腫瘤T分期和淋巴結轉移N分期明顯關聯(P<0.05)，見表1。PCR檢測顯示，ADAM10 mRNA在下咽癌組織中表達水平為0.088±0.051，明顯高于癌旁組織中0.046±0.023(P<0.01)。Western印跡檢測顯示，ADAM10蛋白在下咽癌組織中表達水平為0.992±0.263，明顯高于癌旁組織中0.506±0.229(P<0.01)，見圖1。

表1 臨床病理參數與MiR-140-5p表達的關系(n)

圖1 ADAM10蛋白在癌旁組織和下咽癌組織中表達情況

2.2 轉染MiR-140-5p上調、MiR-140-5p下調與ADAM10干擾后檢測has-MiR-140-5p和ADAM10的表達情況 PCR檢測顯示，MiR-140-5p上調組MiR-140-5p表達水平為0.145±0.025，明顯高于陰性對照組的0.051±0.013(P<0.05)。MiR-140-5p下調組MiR-140-5p表達水平為0.011±0.003，明顯低于陰性對照組的0.036±0.009(P<0.05)。空白對照組與陰性對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。ADAM10干擾實驗組ADAM10 mRNA表達水平為0.020±0.005，明顯低于陰性對照組的0.691±0.018(P<0.05)；進一步行Western印跡檢測顯示，ADAM10干擾實驗組蛋白表達水平為0.422±0.056，明顯低于空白對照組1.016±0.321和陰性對照組1.150±0.406(P<0.01)，見圖2。

圖2 ADAM10干擾實驗中各組ADAM10蛋白表達情況

A.遷移實驗陰性對照組；B.遷移實驗MiR-140-5p上調組；C.侵襲實驗陰性對照組；D.侵襲實驗MiR-140-5p上調組圖3 Transwell實驗觀察MiR-140-5p上調對FaDu細胞遷移和侵襲力的影響(×100)

2.3 MiR-140-5p上調對FaDu細胞的影響 圖3可見，遷移實驗中，MiR-140-5p上調組每視野下平均遷移細胞數分別為95.444±18.159，明顯低于陰性對照組的160.451±16.005(P<0.05)。侵襲實驗中，MiR-140-5p上調組每視野下平均遷移細胞數分別為75.000±6.726，明顯低于陰性對照組的103.557±10.747(P<0.05)。可見上調MiR-140-5p表達后腫瘤細胞遷移和侵襲力明顯降低，其在下咽癌中起到抑癌基因作用。

2.4 MiR-140-5p對FaDu細胞中ADAM10蛋白表達的影響和MiR-140-5p下調對FaDu細胞的影響及與ADAM10蛋白表達的關系 MiR-140-5p表達上調后，實驗組的ADAM10蛋白表達水平明顯低于陰性對照組；MiR-140-5p表達下調后，實驗組的ADAM10蛋白表達水平明顯高于陰性對照組。提示MiR-140-5p可抑制ADAM10蛋白表達。使用FaDu細胞同時轉染MiR-140-5p inhibitor和si-ADAM10 RNA時，發現si-ADAM10 RNA可在一定程度上逆轉MiR-140-5p下調對ADAM10蛋白的升高作用。遷移實驗中，對照組、ADAM10干擾實驗組、MiR-140-5p下調組以及MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染組的遷移細胞數分別為：158.442±12.585、100.005±18.458、285.441±13.775、227.795±30.259，MiR-140-5p下調實驗組遷移細胞數明顯增加，ADAM10干擾實驗組遷移細胞數明顯降低(P<0.05)。侵襲實驗中，對照組、ADAM10干擾實驗組、MiR-140-5p下調組以及MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染組的遷移細胞數分別為：105.910±9.446、85.444±5.139、185.561±19.569、139.665±7.139，MiR-140-5p下調實驗組遷移細胞數明顯增加，ADAM10干擾實驗組遷移細胞數明顯降低(P<0.05)。而MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染實驗組發現，ADAM10下調可逆轉MiR-140-5p對FaDu細胞遷移和侵襲的促進作用。見圖4～圖6。

圖4 上調MiR-140-5p對ADAM10表達的影響

1.對照組；2.MiR-140-5p下調組；3.ADAM10干擾組；4.MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染組圖5 下調MiR-140-5p對ADAM10表達的影響

圖6 Transwell實驗觀察下調MiR-140-5p表達和下調ADAM10對FaDu細胞遷移和侵襲力的影響(×100)

3 討 論

異常表達的miRNA在腫瘤發生、發展中具有重要作用，其中MiR-140-5p在多種腫瘤中發揮抑癌基因的角色，例如：MiR-140-5p在肝癌組織中明顯下調，上調其表達，可明顯降低腫瘤的轉移和侵襲力〔4〕。但目前關于MiR-140-5p對下咽癌發生、發展的調控機制仍未見系統報道。本次研究顯示，MiR-140-5p在下咽癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織，并與腫瘤T分期和淋巴結轉移分期之間存在明顯相關性。通過轉染技術上調MiR-140-5p在FaDu細胞中表達后，細胞的遷移、侵襲力明顯降低；而上調其表達，細胞遷移、侵襲力明顯增加。

ADAMs家族是Ⅰ型跨膜蛋白家族，廣泛參與腫瘤的額病理過程〔5〕。ADAM10作為ADAMs家族一員，在多種腫瘤組織中高表達。研究顯示，ADAM10在非小細胞肺癌組織中高表達，干擾ADAM10表達可降低其遷移和侵襲能力〔6〕。說明ADAM10在腫瘤發生、發展中發揮重要作用。本次研究顯示，ADAM10在下咽癌組織中高表達，但其表達水平與臨床病理特征無明顯關聯，可能與本次研究樣本量較少有關，需進一步探討。下調FaDu細胞中ADAM10表達水平可明顯降低FaDu細胞的遷移、侵襲力，提示ADAM10作為致癌基因可影響下咽癌的發生、發展。

miRNA可調控40%以上的蛋白編碼基因，探尋靶基因有助于明確miRNA在腫瘤轉移、侵襲中的作用機制。依據miRNA配對原則使用靶基因數據庫預測MiR-140-5p的靶基因，發現ADAM10與腫瘤組織惡性程度明顯相關。基于上述研究結論，本次研究中將ADAM10作為MiR-140-5p的靶基因進一步探討對老年咽癌的作用。結果顯示，上調FaDu細胞中的MiR-140-5p表達，ADAM10蛋白表達明顯降低；下調MiR-140-5p表達后ADAM10蛋白表達明顯增加；同時下調ADAM10表達可有效逆轉MiR-140-5p下調對下咽癌細胞遷移、侵襲能力的增強作用。提示MiR-140-5p可通過下調致癌基因ADAM10來抑制下咽癌細胞的遷移、侵襲力。

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〔2016-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳 彤(1986-)，男，副主任醫師，主要從事耳鼻咽喉頭頸外科臨床研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1588-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.010