丹皮酚對肝癌細胞增殖凋亡及JAK-STAT信號通路的影響

于洋洋 梁明輝

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

丹皮酚對肝癌細胞增殖凋亡及JAK-STAT信號通路的影響

于洋洋 梁明輝

(齊齊哈爾醫學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探究丹皮酚(Pae)對肝癌細胞增殖凋亡及JAK-STAT信號通路的影響。方法 采用MTT法檢測7.5、15、22.5、30、60 mg/L Pae 對HepG2細胞的抑制作用；采用流式細胞儀檢測60 mg/L Pae作用HepG2細胞48 h后細胞凋亡情況；qRT-PCR法檢測Pae處理對HepG2細胞Stat3、Stat5 mRNA的影響；Western印跡檢測Pae處理JAK-STAT信號通路蛋白表達的影響。結果 Pae對HepG2細胞的抑制作用與培養時間和藥物劑量呈依賴性，當Pae濃度為60 mg/L，處理細胞72 h時抑制效果最佳;流式細胞儀檢測顯示對照組細胞未出現大量凋亡，經60 mg/L Pae處理72 h后的HepG2細胞出現大量凋亡，處理組凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，不同濃度Pae作用HepG2細胞 48 h后，STAT3、STAT5基因表達量逐漸降低(P<0.05)，且與Pae劑量呈依懶性；Western印跡檢測結果顯示60 mg/L Pae 處理HepG2細胞48 h后，JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白表達量均顯著低于對照組。結論 Pae能夠抑制肝癌細胞HepG2增殖、誘導其凋亡，其機制可能與抑制JAK-STAT信號通路STAT3、STAT5基因和蛋白表達相關。

丹皮酚；HepG2細胞；凋亡；信號轉導和轉錄活化蛋白

目前臨床上治療肝癌主要以手術和化療為主，95%的患者在確診時已為晚期，化療藥物雖然對患者病情具有一定控制作用，但其毒副作用較大〔1，2〕。丹皮酚(Pae)是從牡丹根部提取的化合物，具有消炎、解熱、鎮痛的療效，研究表明Pae對肝癌細胞具有一定的抑制作用〔3〕。本研究旨在探討Pae對肝癌細胞HepG2抑制凋亡及Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉導和轉錄活化蛋白(JAK/STAT)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細胞HepG2細胞購于上海生物細胞研究所，本院凍存。丹皮酚注射液購于北京雙鶴藥業有限公司，批號：Z31020399，規格：2 ml/10 mg；胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、胰蛋白酶購于杭州四季青有限公司，MTT、DMSO購于Sigma公司；鏈霉素和青霉素購于華北制藥有限公司；2×SYBR Green Mix 訂購于Takara公司；兔抗人JAK1、JAK2單克隆抗體購于Cell Signaling Technoloy 公司，鼠抗人STAT3單抗購于Origene 公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記二抗山羊抗兔IgG購于中杉金橋公司。二氧化碳培養箱購于Thermo公司；流式細胞儀購于美國Thermo Scientific公司；全自動酶標儀購于Nano Drop公司；熒光定量PCR儀器購于Bio-Red公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 從超低溫冰箱中取出凍存細胞，置于30℃水浴中使細胞解凍，加入5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，添加0.2%胰蛋白酶進行消化后于DMEM培養基中終止消化，加入10%FBS的DEME培養液，移液槍吹打培養液使細胞密度為106個/m3，置于5% CO2培養箱內培養，當細胞貼壁生長達到80%時加入胰蛋白酶消化，用DMEM培養基洗滌3次，800 r/min離心3 min，收集細胞。按照1∶3比例進行傳代培養，第三代細胞用于后續研究。

1.2.2 MTT法檢測Pae對HepG2細胞的抑制作用 將生長至對數期的HepG2細胞接種于96孔板中加入100 μl DEME培養液，將Pae用培養基進行稀釋使濃度為7.5、15、22.5、30、60 mg/L，將稀釋后的藥物100 μl加入培養板，上述5組每組設置4個重復，同時以未加入Pae處理的孔作為對照組，分別培養24、48、72 h，培養結束后加入20 μl MTT，37℃反應4 h，去除細胞上清液后加入200 μl DMSO，37℃孵育20 min，于波長570 nm下測定各組的濃度，細胞存活率=OD實驗組/OD空白組×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測Pae對HepG2細胞凋亡的影響 以未進行Pae處理的細胞為對照組，以60 mg/L Pae 處理后的HepG2細胞為實驗組細胞，培養使細胞液密度為103個/m3，37℃反應48 h后收集細胞，加入PBS溶液洗滌。對照組添加200 μl DMSO溶液，實驗組加入100 μl DMSO和20 μl PI，避光反應20 min，采用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.2.4 qRT-PCR法檢測Pae處理對HepG2細胞STAT3、STAT5 mRNA的影響 收集處理后的HepG2細胞，參照細胞總RNA提取試劑盒進行細胞RNA提取，采用mRNA反轉錄試劑盒將mRNA翻轉為cDNA，STAT3熒光定量引物序列：正義：5′-TTGGAGGCAGGAATAGG-3′ 反義：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，STAT5引物序列：正義：5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′反義：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，以β-actin 為內參，序列：正義5′-TCCACCGCAAATGCTTCTAG-3′，反義：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。20 μl反應體系：10 μl 2×SYBR Green Mix，正義、反義引物各1 μl，H2O 7 μl，10×cDNA模板1 μl，反應程序95℃ 3 min，94℃ 10 s、56℃ 20 s，72℃ 2 min，30個循環，72℃ 10 min，95℃ 10 s。利用CFX manager 3.0軟件進行CQ值分析，以β-actin作為內參基因，按照2-ΔΔCQ算法進行基因相對定量分析。

1.2.5 Western印跡檢測JAK-STAT信號通路蛋白的表達 收集處理后的細胞液提取細胞總蛋白，BCA法測定提取后蛋白的濃度，配制8%、12%的分離膠與濃縮膠，取30 μg蛋白上樣，蛋白Marker 5 μl，濃縮膠電壓設置為80 V，分離膠電壓為120 V，反應結束將蛋白凝膠轉移至PVDF膜上(JAK1和JAK2：200 mA，100 min；STAT3：90 V，120 min)加入脫脂牛奶封閉4 h，加入一抗(兔抗人JAK1、JAK2，鼠抗人STAT3單抗)4℃震蕩過夜，加入PBS溶液清洗3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下反應2 h，加入PBS溶液清洗3次，10 min/次。將蛋白凝膠用EXL發光后，在暗室中曝光，利用凝膠成像儀對Western印跡產生的條帶進行定量分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1 Western印跡檢測JAK-STAT信號通路蛋白的表達 用60 mg/L Pae 處理HepG2細胞48 h后，JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白表達量均顯著低于對照組。見圖1。

A.未經Pae處理； B：60 mg/L Pae 處理48 h圖1 Western印跡檢測結果

2.2 MTT法檢測Pae對HepG2細胞的抑制作用 不同濃度Pae對HepG2細胞均有一定抑制作用，Pae對HepG2細胞的抑制作用與培養時間和藥物劑量呈依賴性，在相同濃度下，隨著培養時間的延長，細胞的抑制率逐漸增加，相同培養時間內，隨著劑量的增加，細胞的抑制作用逐漸增強。當Pae濃度為60 mg/L，處理細胞72 h時，抑制效果最佳。見圖2。

圖2 HepG2細胞生長抑制曲線

2.3 流式細胞儀檢測HepG2細胞的凋亡 對照組細胞未出現大量凋亡，經60 mg/L Pae處理72 h后的HepG2細胞出現大量凋亡，處理組凋亡率(80%)明顯高于對照組(10%)(P<0.05)。

2.4 qRT-PCR法檢測Pae處理對HepG2細胞STAT3、STAT5 mRNA的影響 選取7.5、15、22.5、30 mg/L Pae 作用HepG2細胞48 h后，與對照組(0.90，0.81)相比，隨著處理濃度的增加，STAT3、STAT5基因表達量逐漸降低(7.5、15、22.5、30 mg/L Pae處理后細胞STAT3、STAT5 mRNA表達量分別為0.80，0.75；0.70，0.60；0.60，0.48；0.50，0.41；P<0.05)，與Pae劑量呈依懶性。

3 討 論

肝癌的發生發展是由多因素、多基因、多步驟共同參與而導致的結果，探究其發生原因主要與以下幾方面相關：(1)癌基因的激活或抑癌基因的失活；(2)肝細胞抗原結構發生變化；(3)信號通路被激活使凋亡機制的失活；(4)細胞增殖異常、血管內皮生長因子受到外源刺激〔4～6〕。

牡丹皮性寒、味苦有清熱解毒、活血化瘀的功效，具有保肝、消炎、抗癌、保護神經、抗過敏性哮喘等作用，Pea是從牡丹皮中提取的有效化學成分〔7〕，近期有較多文獻報道Pae能夠通過多種途徑抑制控制腫瘤細胞的增殖，動物實驗表明Pae能夠通過升高血清中SOD、GSH-Px抑制脂質過氧化進而抑制癌細胞增殖〔8〕，體外實驗表明Pea能夠抑制乳腺癌細胞以及宮頸癌細胞增殖〔9〕。此外，Pae與姜黃素聯合使用后抗腫瘤活性得到進一步提高，在Pae對肝癌MHCC97的抑制機制實驗結果中顯示Pae通過降低AKT表達、升高PTNE基因表達而抑制癌細胞增殖〔10，11〕。本研究結果表明Pae能夠顯著抑制肝癌細胞增殖，隨著PAE處理濃度的增加以及培養時間的延長其抑制作用逐漸增強，而且進一步流式細胞檢測也顯示經Pae處理后細胞出現大量凋亡，表明Pae具有誘導肝癌細胞凋亡的作用。

JAK-STAT信號通路在肝癌的發生中發揮重要作用，在正常情況下JAK和STAT通過反饋調節模式維持相對穩定狀態，機體產生病變后激活JAK蛋白磷酸化，激活信號傳導途徑，使STAT蛋白中的酪氨酸殘基發生磷酸化，活化后形成同源二聚體進入細胞核中與相應靶基因結合從而調控其進行表達。相關研究表明STATS蛋白家族中的大部分成員對細胞增殖、凋亡以及細胞免疫方面產生一定影響。研究表明STAT3、STAT5被異常激活后，能夠引起下游靶基因如Survivin、Bcl-2、caspases、c-myc、Cyclin D1等的異常表達，這些基因均與細胞增殖凋亡等病理過程相關〔12〕。有研究表明STAT3在乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌中均大量表達，而正常組織中表達量較低〔13〕。在研究JAK-STAT信號通路與肝癌患者預后關系中結果顯示JAK-STAT途徑中JAK、STAT蛋白過度表達不利于患者預后〔14〕。有文獻報道JAK化學阻斷劑能夠誘導白血病細胞凋亡，而不影響正常細胞〔15〕。本研究結果顯示使用Pae處理后HepG2細胞中STAT3、STAT5基因表達量降低，提示這兩者基因的表達與肝癌細胞抑制相關，進一步從蛋白水平上研究結果顯示JAK1、JAK2、STAT3蛋白表達量下降，這與相關文獻〔13〕報道Pae能誘導BEL-7402細胞凋亡相符，提示JAK-STAT信號通路在肝癌發展中占有重要作用，Pae處理后能夠通過影響JAK-STAT信號通路蛋白表達，抑制肝癌細胞增殖。

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〔2016-11-30修回〕

(編輯 郭 菁)

齊齊哈爾市科技計劃指令性項目(XCP-201401)

梁明輝(1975-)，男，碩士，高級實驗師，主要從事醫學影像學研究。

于洋洋(1989-)，男，主要從事臨床醫學研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)07-1591-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.011