OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達(dá)及生物學(xué)功能

王 芳 鐘彬武 聶晶晶 趙自然

(大慶油田總醫(yī)院整形外科，黑龍江 大慶 163001)

OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達(dá)及生物學(xué)功能

王 芳 鐘彬武 聶晶晶 趙自然1

(大慶油田總醫(yī)院整形外科，黑龍江 大慶 163001)

目的 通過研究OPN與TGF-β1在正常皮膚、扁平瘢痕及瘢痕疙瘩三組中的表達(dá)規(guī)律，探討兩者在瘢痕疙瘩形成中的意義。方法 應(yīng)用免疫組化法 (SP法)結(jié)合計算機(jī)病理圖像分析檢測三組患者中OPN與TGF-β1的表達(dá)。分析OPN與TGF-β1在各組中的表達(dá)水平差異。結(jié)果 OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩組中的陽性表達(dá)率及IOD值與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達(dá)具有正相關(guān)。結(jié)論 OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達(dá)呈正相關(guān)，與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。

瘢痕疙瘩； OPN；TGF-β1

瘢痕疙瘩一直是外科研究的熱點及難點，瘢痕疙瘩的形成機(jī)制不清，導(dǎo)致臨床治療困難。TGF-β1在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。有研究發(fā)現(xiàn)OPN與創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕形成有關(guān)〔1〕，在許多纖維性疾病中，OPN和TGF-β1均呈高表達(dá)，OPN與TGF-β1具有協(xié)同效應(yīng)，共同促進(jìn)纖維性疾病的發(fā)生及發(fā)展〔2,3〕。OPN及TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達(dá)以及兩者的相關(guān)性鮮見研究。本實驗擬分析OPN與TGF-β1的相關(guān)性及在瘢痕疙瘩形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要的實驗試劑及儀器 兔抗人OPN單克隆抗體與兔抗人TGF-β1單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。電熱恒溫干燥箱購自中國上海實驗儀器總廠。高精度輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)購自日本的LAICA。顯微鏡購自日本的OLYMPUS。石蠟包埋機(jī)、恒溫孵化箱購自日本的SANYO。

1.2 實驗標(biāo)本的來源及分組 所有標(biāo)本供體均取自門診及住院患者(所有患者均知情并同意)。取材部位為胸部、腹部、面部、四肢。實驗標(biāo)本分為瘢痕疙瘩組(KG)標(biāo)本20例，扁平瘢痕組(SG)標(biāo)本23例，正常皮膚組(NG)標(biāo)本16例。

1.3 實驗方法 應(yīng)用SP免疫組化染色方法檢測OPN、TGF-β1在瘢痕疙瘩、扁平瘢痕及正常皮膚中的表達(dá)：所有標(biāo)本經(jīng)過甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm切片,一張行HE染色，一張行免疫組化檢測，一張PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 試驗結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 三組中OPN與TGF-β1陽性表達(dá)率的判斷 OPN與TGF-β1陽性細(xì)胞主要表現(xiàn)為棕黃色顆粒或黃褐色顆粒，主要分布于胞質(zhì)中。在低倍鏡(100×)視野下選取視野，于高倍鏡(400×)下從表皮到皮下依次選取5個視野并計算陽性細(xì)胞率。按切片中顯色細(xì)胞數(shù)比例計分(分別為0～3分)及按切片中細(xì)胞顯色強(qiáng)度計分(分別為0～3分)。

1.4.2 三組中OPN與TGF-β1累積光密度(IOD)的測定 在低倍鏡(100×)視野下掃視整個組織切片 ,選取背景對比良好、陽性細(xì)胞數(shù)量密集的視野，于高倍鏡(400×)下從表皮到皮下依次取5個視野后采用Image pro plus 6.0軟件分析系統(tǒng)測量圖像，測量指標(biāo)為IOD值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0軟件行χ2檢驗或t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 OPN在三組中的陽性表達(dá)率及IOD值 OPN在NG表達(dá)數(shù)目少且稀疏；在SG中全層均有表達(dá)，染色顆粒的數(shù)量及染色強(qiáng)度均高于正常皮膚組；在瘢痕疙瘩的全層均有表達(dá)，無論是陽性染色顆粒的數(shù)目、染色強(qiáng)度還是陽性顆粒的密集程度明顯強(qiáng)于SG及NG。見表1，圖1。OPN在KG、SG、NG三組中的IOD值分別為(455 103.75±145 907.22)、(243 162.05±54 810.94)、(38 952.65±8 216.19)，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 OPN在各組中的表達(dá)(n)

2.2 TGF-β1在三組中的陽性表達(dá)率及IOD值 TGF-β1在NG中的表達(dá)為陰性；在SG中主要表達(dá)于瘢痕表皮基底層細(xì)胞；在瘢痕疙瘩的全層均有表達(dá)，無論是陽性染色顆粒的數(shù)目、染色強(qiáng)度還是陽性顆粒的密集程度明顯強(qiáng)于SG及NG。見表2，圖1。TGF-β1在KG、SG、NG三組中的IOD值分別為(335 432.9±60 038.73)，(19 339.05±4 776.14)，(4 501.54 ±577.27)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中表達(dá)的相關(guān)性 OPN和TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達(dá)具有相關(guān)性(P<0.05)。見表3。

表2 TGF-β1在各組中的表達(dá)(n)

圖1 OPN、TGF-β1在三組中的表達(dá)(×400)

TGF-β1OPN-+ r值P值-1100+01210.480.032 0143 0033

3 討 論

OPN作為一種重要ECM組分，廣泛分布于人體組織中，具有多種生物學(xué)活性。越來越多的國內(nèi)外研究結(jié)果證實OPN在纖維化疾病及腫瘤中呈高表達(dá)，OPN與纖維化疾病(肝、肺、腎)及腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有密切的相關(guān)性，新近研究發(fā)現(xiàn)OPN與創(chuàng)面修復(fù)及瘢痕形成有關(guān)〔4〕。瘢痕疙瘩作為一種纖維性疾病，同時具有腫瘤的生物學(xué)性質(zhì)，本試驗中OPN在瘢痕疙瘩組高表達(dá)，為瘢痕疙瘩的研究提供了新的思路。

TGF-β有3種亞型，分別是TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，其中TGF-β1所占的比例最高。TGF-β1對很多纖維化疾病具有促進(jìn)作用。動物實驗表明，局部給裸鼠皮下注射TGF-β1可致注射部位局部纖維化，而全身應(yīng)用TGF-β1可使肝腎肺等主要器官纖維化〔5〕。TGF-β1在瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制中起到重要的促進(jìn)作用，增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中可以檢測到病變部位TGF-β1高表達(dá)〔6〕。

瘢痕疙瘩是一種纖維性疾病，同時具有腫瘤的生物學(xué)特征，OPN及TGF-β1在瘢痕疙瘩中表達(dá)特點的研究較少，國內(nèi)尚未見到報道。本實驗結(jié)果表明OPN與TGF-β1在瘢痕疙瘩中的表達(dá)呈正相關(guān)，因此推測兩者具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展。

瘢痕疙瘩的形成主要有以下幾方面：①細(xì)胞外基質(zhì)中膠原合成與降解失衡；②成纖維細(xì)胞的大量增殖與凋亡抑制；③細(xì)胞因子的相互作用及調(diào)控。根據(jù)國內(nèi)外的相關(guān)性研究及本實驗結(jié)果，我們推測OPN及TGF-β1可能與以下瘢痕疙瘩的形成因素有關(guān)：①調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積：有研究表明在瘢痕疙瘩形成與在形成中局部合成的生長因子及細(xì)胞因子相互作用促進(jìn)過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積〔7〕。OPN是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有改變細(xì)胞外基質(zhì)的作用，TGF-β1亦有改變細(xì)胞外基質(zhì)成分的作用，兩者通過改變合成與降解的動態(tài)平衡，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，減緩細(xì)胞外基質(zhì)的降解以達(dá)到促進(jìn)瘢痕疙瘩形成。②通過調(diào)控共同促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，誘導(dǎo)新血管生成：OPN及TGF-β1誘導(dǎo)瘢痕疙瘩中新血管生成，主要是通過與其相應(yīng)受體結(jié)合后促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生。血管內(nèi)皮細(xì)胞的初始反應(yīng)由TGF-β1介導(dǎo)，通過與血管相鄰的ECM成纖維細(xì)胞表達(dá)TGF-β1 mRNA而被放大，導(dǎo)致鏈鎖效應(yīng)〔8〕。③OPN與TGF-β1調(diào)控的信號通路：OPN與TGF-β1在很多纖維化疾病(肝、腎、肺)纖維化過程中具有協(xié)同作用，促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。在肝硬化中OPN可通過TGF-β1/Smad 信號傳導(dǎo)通路直接激活HSC而導(dǎo)致肝纖維化的形成。有學(xué)者在小鼠肝纖維化實驗中證實，OPN在肝組織中大量表達(dá)會直接誘導(dǎo)TGF-β1 mRNA上調(diào)，進(jìn)而進(jìn)一步激活HSC，產(chǎn)生大量的ECM而引起肝纖維化〔2〕。

瘢痕疙瘩的防治是醫(yī)學(xué)界的難題，我們的實驗中OPN及TGF-β1在瘢痕疙瘩組織中均呈高表達(dá)且兩者具有相關(guān)性，因此推測兩者通過協(xié)同作用共同促進(jìn)瘢痕疙瘩的發(fā)生及發(fā)展，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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〔2016-07-15修回〕

(編輯 郭 菁)

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部整形外科

王 芳(1984-)，女，主治醫(yī)師，主要從事整形外科臨床研究。

R622+.9

A

1005-9202(2017)07-1596-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.013