梨頭草提取物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的修復作用

張 雷 郭玉成 石 鑫 趙靜怡 李建會 楊 闊 郎桂森

(承德醫學院，河北 承德 067000)

梨頭草提取物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的修復作用

張 雷 郭玉成 石 鑫 趙靜怡 李建會 楊 闊 郎桂森1

(承德醫學院，河北 承德 067000)

目的 探討犁頭草提取物對四氯化碳(CCl4)誘導大鼠急性肝損傷的修復效果和抗氧化作用。方法 體外抗氧化評價主要考察對DPPH、ABTS、羥自由基以及還原力的清除率，利用CCl4誘導昆明小鼠肝損傷后，以不同劑量的犁頭草提取物灌胃7 d并且測定血清中天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、總膽紅素(TB)和肝腎組織中的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)以及丙二醛(MDA)等指標，HE 染色觀察肝臟病理組織學變化。結果 體外抗氧化實驗證明犁頭草提取物具有較強的抗氧化效果，各劑量組均能降低CCl4致小鼠急性肝損傷血AST、ALP、ALT、GGT和TB的升高，降低肝腎中MDA含量，增強 SOD、CAT和GSH活性，減輕 CCl4對肝組織的病理損傷。結論 犁頭草提取物對 CCl4致小鼠急性肝損傷具有一定的保護作用。

犁頭草；護肝；抗氧化

犁頭草屬于堇菜科堇菜屬草本植物,為一種侗族民間常用中藥,主要分布華中及華南各省,多生于山坡林邊、 溪邊或荒山草地中〔1〕。在民間常用于清熱解毒,除膿消炎、治癰疽、外傷感染、瘰疬、瘡瘍、扁桃體炎、瘡瘍等癥。現代藥理實驗表明,犁頭草還具有抗金黃色葡萄糖球菌及治療急慢性骨髓炎等多種藥理作用〔2,3〕，在民間常用來治療肝病，但相關報道甚少。本實驗采用體外抗氧化和體內抗氧化實驗，結合四氯化碳(CCl4)致小鼠急性化學性肝損傷模型，觀察犁頭草提取物保護急性肝損傷和抗氧化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 犁頭草采購于江蘇省恒順大藥房，鑒定為堇菜科堇菜屬植物犁頭草的干燥全草。種在40℃～50℃烘干后用中藥粉碎機粉碎過60目篩。清潔級健康KM小白鼠，雄性體質量(20±2)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCKK(京)2012-0001，分籠飼養，飼料充足飲水不限，室溫20℃～25℃，適應環境5 d后用于實驗。谷氨酰轉肽酶(GGT)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、總膽紅素(TB),過氧化氫酶(CAT)，丙二醛(MDA)測試盒購自西安臻品生物制品有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備 Infinite M200TECAN 酶標儀(瑞士TECAN集團公司)；AL104電子天平(Mettler-Toledo儀器公司)；RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；CTXNW-10B超聲波循環提取機(北京弘祥生物技術開發公司)；DU-800紫外掃描分光光度計(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 犁頭草提取物的提取 稱取干燥草全草5 kg，用65%乙醇浸泡24 h后利用循環超聲波提取儀提取45 min，減壓濃縮回收乙醇得水溶液，上D-101大孔樹脂，先用20%的乙醇洗脫去除雜質，再用60%的乙醇洗脫，得總黃酮的乙醇溶液，減壓濃縮回收乙醇后烘干粉碎得犁頭草提取物粉末。

1.3.2 犁頭草提取物體外抗氧化分析

1.3.2.1 犁頭草提取物對DPPH自由基的清除率 參照文獻〔4〕將樣品用甲醇配制成一系列濃度(50～300 μg/ml)；加入提前配制的DPPH溶液(13 mg DPPH自由基甲醇定容至25 ml,避光放置)。分別用不同濃度的樣品溶液 0.1 ml加入3.5 ml DPPH 甲醇溶液，振搖混勻后置于暗室中靜30 min，在 517 nm波長處測定吸光度，維生素C(VC)為對照，每份樣品平行操作3次，計算公式：清除率(%)=〔(AC-AS)/AC〕× 100%。式中AC為3.5 ml DPPH溶液與0.1 ml甲醇混合后的吸光度，AS為3.5 ml DPPH 溶液與0.1 ml樣品溶液混合后的吸光度。

1.3.2.2 犁頭草提取物對ABTS自由基的清除率 按照文獻〔5〕將等量的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀水溶液混合，避光放置 12～16 h。用無水乙醇將該溶液稀釋至734 nm波長處的吸光度為(0.7±0.02)，得到 ABTS 工作液。將樣品用甲醇配制成一系列濃度(25～150 μg/ml)，取0.15 ml樣品加入2.85 ml ABTS自由基工作液，混合30 min后測定517 nm處吸光度，VC為對照，計算公式為：清除率(%)=〔(AC-AS)/AC〕×100%。式中AC為2.85 ml ABTS溶液與0.15 ml甲醇混合后的吸光度，AS為2.85 ml ABTS溶液與0.15 ml樣品混合后的吸光度。

1.3.2.3 犁頭草提取物對羥自由基的清除率 利用犁頭草提取物清除羥基自由基能力的強弱來測定其抗氧化性的大小，參照文獻〔6〕方法加以適當改進。將犁頭草提取物配制成不同質量濃度(125～500 μg/ml)的樣品溶液，依次加入1 ml樣品、1 ml 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和1 ml 9 mmol/L FeSO4溶液和1 ml 8.8 mmol/L的 H2O2溶液，混勻后于37℃恒溫水浴30 min，測510 nm處吸光度。VC為對照，每份樣品平行操作 3次。羥自由基清除能力由以下公式計算：清除率(%)=〔(AS-AJ)/(AC-AJ)〕×100%。式中，AS為加入樣品的反應溶液吸光值，AJ為用水代替樣品的溶液吸光值，AC為用水代替樣品和H2O2的溶液吸光值。

1.3.2.4 犁頭草提取物還原能力的測定 參照文獻〔7〕將樣品液配制成一系列的濃度(50～200 μg/ml)，分別取1.0 ml，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)1 ml和1%的鐵氰化鉀溶液1 ml，充分混合以后，立即放入在50℃下保溫20 min，取出立即冷卻至室溫，加入4.0 ml 10%三氯乙酸充分混合后終止反應。吸取反應液4.0 ml,加入蒸餾水2 ml和0.5 ml 0.1% FeCl3溶液，混合均勻，暗室反應30 min后在700 nm波長處比色，VC為對照。

1.3.3 犁頭草提取物對CCl4誘導肝損傷的修復效果

1.3.3.1 肝損傷模型的建立和處理 昆明小白鼠60只，隨機分成 6 組：正常對照組(在治療期間喂養10 ml/kg體重0.3%的羧甲基纖維素鈉)；肝損傷模型組(給予10 ml/kg體重0.3%的羧甲基纖維素鈉)；水飛薊素組(給予100 mg/kg體重的水飛薊素)；犁頭草提取物低、中、高劑量組(分別給予100、200和400 mg/kg體重的犁頭草提取物)。每天灌胃1次，連續6 d，末次給藥2 h 后，除正常對照組按5 ml/kg體重腹腔注射體積分數為 6%的 CCl4橄欖油溶液1次，禁食不禁水24 h后，麻醉后眼眶取血，小鼠血樣4℃ 3 500 r/min離心10 min后取血清。麻醉處死小鼠，剖腹取出肝臟和腎臟于冷的生理鹽水中洗凈血液備用；另外剪肝小葉置于10%甲醛中固定，待病理檢測。

1.3.3.2 生化指標的測定 自動生化分析儀檢測血清 ALT、AST、ALP、GGT和TB 的活性，分別取肝、腎組織加入生理鹽水于冰浴中制成組織勻漿，離心后取上清液按試劑盒說明測定SOD、CAT、GSH和MDA的含量。

1.3.3.3 肝臟組織的病理切片觀察 取小鼠右葉相同位置肝組織，用4℃生理鹽水沖洗后，濾紙拭干，浸泡于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，常規切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化。

1.4 統計學方法 應用SPSS16.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1 犁頭草提取物的體外抗氧化效果 犁頭草提取物對DPPH的清除率呈劑量依賴性，同樣，對ABTS的清除效果、對羥自由基同樣表現出明顯的清除率，在濃度30～150 μg/ml范圍內，還原力也是濃度依賴性，雖然犁頭草提取物對以上自由基的清除效果和還原力不如VC，但是依然體現出了較強的體外抗氧化能力。見圖1。

2.2 犁頭草提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型血清中ALP、AST、ALT、GGT和TB的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清中的ALP、ALT、ASP、GGT、TB的含量升高(P<0.001)，經水飛薊素和犁頭草提取物治療后，大鼠血清ALP、ALT、ASP、GGT和TB含量均有明顯降低(P<0.01或P<0.001)，見表1。

圖1 犁頭草提取物的體外抗氧化效果

2.3 犁頭草提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝和腎組織中SOD、CAT、GSH和MDA的影響 與正常對照組比較，模型組鼠肝腎組織SOD、CAT和GSH顯著降低(P<0.001)，而MDA的含量顯著提高(P<0.001),與模型組比較，水飛薊素和不同劑量犁頭草提取物組小鼠，肝腎組織SOD、CAT和GSH顯著升高(P<0.001或P<0.01)，而MDA的含量顯著降低(P<0.001或P<0.01)。見表2。

2.4 犁頭草提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型小鼠的肝組織病理形態學的影響 正常對照組小鼠肝臟的肝小葉結構正常，肝細胞圍繞中央靜脈，成輻射狀排列，小葉間血管和膽管清晰，肝細胞無變形、壞死等損傷性改變；模型組小鼠肝結構紊亂，肝細胞出現嚴重的水樣變性或脂肪變性，甚至壞死，伴炎癥細胞浸潤；水飛薊素組小鼠肝小葉結構基本正常，但肝細胞排列紊亂，可見少量肝細胞水樣變性或脂肪變性，偶見壞死，伴炎癥細胞浸潤；與模型組比較，犁頭草提取物各劑量組明顯改善小鼠肝小葉結構，不同程度地減少 CCl4誘導肝損傷中肝細胞中的炎性細胞浸潤、水腫和壞死等，見圖2。

組別ALT(IU/L)AST(IU/L)ALP(IU/L)GGT(IU/L)TB(mg/dl)正常對照組48.43±1.3558.53±1.7868.34±2.3442.23±1.630.58±0.01模型組138.23±7.581)213.54±9.871)187.47±16.321)134.56±7.341)1.69±0.051)水飛薊素64.35±6.184)76.58±6.324)82.23±4.234)58.68±3.894)0.75±0.074)犁頭草提取低劑量組124.32±6.452)156.45±15.623)152.15±7.543)108.36±6.353)1.25±0.083)犁頭草提取中劑量組92.46±2.344)128.73±7.544)1103.42±6.163)83.355±2.874)1.03±0.044)犁頭草提取高劑量組67.32±3.184)86.54±6.124)85.23±5.464)63.52±4.564)0.83±0.074)

與正常對照組比較：1)P<0.001；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，4)P<0.001；下表同

組別肝臟組織SOD(U/mg)CAT(U/mg)MDA(nmol/mg)GSH(mg/g)腎臟組織SOD(U/mg)CAT(U/mg)MDA(nmol/mg)GSH(mg/g)正常對照組285.15±5.4568.53±2.161.47±0.049.18±0.25234.65±3.6558.65±1.652.25±0.058.56±0.35模型組179.25±10.861)32.53±3.181)3.52±0.201)3.76±0.181)125.68±6.341)19.05±4.341)4.35±0.151)3.65±0.081)水飛薊素組241.54±5.872)61.25±2.354)1.64±0.094)8.72±0.344)206.98±4.613)42.65±2.784)2.65±0.084)7.34±0.324)犁頭草提取物低劑量組208.07±9.253)42.14±1.082)2.87±0.082)4.23±0.162)138.65±10.352)26.34±4.352)4.13±0.163)4.12±0.081)犁頭草提取物中劑量組234.04±6.323)51.35±2.073)2.18±0.053)6.65±0.313)174.31±12.054)31.65±4.164)3.42±0.084)5.86±0.232)犁頭草提取物高劑量組258.45±8.164)60.25±3.074)1.75±0.044)7.89±0.154)198.61±7.534)38.34±4.054)2.95±0.074)7.34±0.084)

圖2 各組小鼠肝組織病理切片(HE，×200)

3 討 論

CCl4是典型的致急性肝損傷物質，高活性的代謝產物直接或間接導致的肝細胞脂質過氧化作用，導致許多活性物質如各種轉氨酶和磷酸酶就會從肝臟逸出〔8〕。肝細胞出現嚴重的水樣變性或脂肪變性，甚至壞死，伴炎癥細胞浸潤有關，從病理學觀察可以得到驗證〔9〕。CCl4經肝臟微粒體混合功能氧化酶系統作用后，生成三氯甲基游離基(·CCl3)，·CCl3基的反應非常迅速，與氧反應生成CCl3OO·〔10〕。這些自由基與蛋白質和脂類反應除去氫原子的不飽和脂質從而引發脂質過氧化，導致細胞膜和肝組織損傷的完整性的損失〔8〕。GSH、SOD和CAT為關鍵抗氧化酶，防止氧化損傷〔11〕。SOD轉化為H2O2和O2，從而參與其他抗氧化酶對氧的毒性，在酶促防御中，CAT是抗氧化防御系統的關鍵組成部分。這種保護機制的靈敏度增強的結果會抑制自由基誘導細胞的損傷。CAT的減少可能會導致許多有害的影響〔12〕。GSH是另一個抗氧化的參數，在肝臟和腎臟的氧化損傷中，GSH是對抗自由基的第一道防線。在CCl4處理的大鼠中，肝GSH活性降低表明對肝細胞的損害程度。MDA 是自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸而引發的脂質過氧化作用的最終分解產物,其含量的多少可反映組織細胞的脂質過氧化速率或強度〔13〕。MDA 含量異常增高會引起細胞損傷。本研究表明利用CCl4致昆明小鼠損傷后，小鼠的肝和腎組織中SOD、CAT和GSH明顯降低，MDA的含量明顯增加，通過犁頭草提取物不同劑量的治療，肝腎組織中的SOD、CAT和GSH的含量都明顯提高，而MDA的含量明顯降低。

綜上所述，犁頭草提取物對 CCl4誘導小鼠肝損傷具有保護作用，且具有結構特異性，其保護機制可能與清除自由基，減輕脂質過氧化，保護肝細胞膜結構和功能的完整性；提高肝細胞內SOD、CAT、GSH活性，增強機體抗氧化能力。

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〔2015-08-05修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省自然科學基金項目(C2009001007)

1 河北省灤平中醫院

張 雷(1976-)，男，碩士，副教授，主要從事醫學教育研究。

R285

A

1005-9202(2017)07-1605-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.016