黃芪注射液減輕缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡的機制

董雅潔 盧鍇鋒 高維娟 錢 濤 謝亞芹

(承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

黃芪注射液減輕缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡的機制

董雅潔 盧鍇鋒 高維娟1錢 濤2謝亞芹

(承德醫學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

目的 探討黃芪注射液減輕缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡的作用機制。方法 取體外無血清原代培養8 d的大鼠海馬神經元，采用隨機數表法分為A組：正常對照組、B組：模型組(缺氧缺糖/復氧復糖組)、C組：黃芪注射液溶劑對照組、D組：黃芪注射液組、E組：二甲基亞砜(DMSO)組、F組：Bax抑制劑組、G組：Bax激動劑組、H組：Bax抑制劑+黃芪注射液組、I組：Bax激動劑+黃芪注射液組。各組除A組均經0.5 h缺氧缺糖，分別采用免疫組化法和RT-PCR法對復氧復糖后0、0.5、2、6、24、72、120 h的Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA的表達進行檢測和比較。結果 各組海馬神經元除0 h外，其他時間點的Bcl-2水平均高于A組，且各組Bcl-2水平均隨時間延長而增高，2 h達到頂峰。除0 h外，其他各時間點H組大鼠海馬神經元的Bcl-2水平均顯著高于其他組(P<0.05)，其次為F組、D組、I組、G組、E組、B/C組、A組，且B組與C組無顯著差異(P>0.05)。各組大鼠海馬神經元除0 h外，其他各時間點的Bax水平均低于A、B組，且各組均隨時間延長而增高，6 h達到頂峰，各組大鼠海馬神經元除0 h外，其他各時間點的Caspase-3 mRNA陽性神經元百分率均高于A組，且各組均隨時間延長而增高，24 h達到頂峰。除0 h外，其他各時間點B組Bcl-2水平和Caspase-3 mRNA陽性神經元百分率均顯著高于其他組(P<0.05)，其次為E組、G組、I組、D組、F組、H組，且B組與C組各時間點比較無顯著差異(P>0.05)。結論 黃芪注射液能夠抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元Bax蛋白的表達，提高Bcl-2蛋白表達，抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡；且Bax激動劑能夠加速缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡，Bax抑制劑能夠減輕缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡。

Bax；黃芪注射液；缺氧缺糖/復氧復糖；海馬神經元；凋亡

臨床上治療缺血性腦損傷的有效途徑之一為抑制細胞凋亡〔1〕。目前常將黃芪注射液作為治療缺血性腦血管病的常用藥物，其能夠顯著抑制全腦缺血再灌注大鼠海馬神經元凋亡，但臨床上并未明確黃芪注射液對缺血性腦血管病患者作用的具體靶點〔2〕。研究表明〔3〕，在腦缺血損傷中，神經元凋亡受多種相關基因及蛋白的調控，其中Bax是與細胞凋亡關系最密切的凋亡調控基因之一。本研究旨在探討黃芪注射液減輕缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 1～2 d SPF級SD大鼠20只，雌雄兼有。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經元原代培養、形態學觀察和純度鑒定 取新生24 h內的SD乳鼠，酒精消毒后迅速取出海馬組織，采用濃度為0.125%的胰蛋白酶消化法加機械吹打法分離細胞，用無血清培養基進行細胞培養。采用細胞免疫化學法檢測海馬神經元特異性烯醇化酶(NSE)和膠質纖維酸性蛋白A(GFAP) 的表達，在顯微鏡下觀察海馬神經細胞的生長情況和純度。

1.2.2 細胞分組及模型制備 取體外無血清原代培養8 d的大鼠海馬神經元，隨機分為正常對照組(A組)、缺氧缺糖/復氧復糖組(B組)、黃芪注射液溶劑對照組(C組)、黃芪注射液組(D組)、二甲基亞砜(DMSO)組(E組)、Bax抑制劑組(F組)、Bax激動劑組(G組)、Bax抑制劑+黃芪注射液組(H組)、Bax激動+黃芪注射液組(I組)。A組：不做任何特殊處理，正常培養；B組：加入與正常對照組培養基等量的無糖Earle液，將培養皿置于37℃溫箱里的缺氧裝置中，壓緊、密閉，快速通入高純氮氣(N2)5 min，以盡快排盡空氣，調分壓至1.5 kPa，繼續緩慢、勻速、連續通入，30 min后換正常無血清培養液，繼續在37℃恒溫、5%CO2飽和濕度培養箱中培養；C組：加入等量的pH7.4的黃芪注射液溶劑即無菌去離子水，處理方法與B組同；D組：加入終濃度為0.5 g生藥/L的黃芪注射液，進行缺氧缺糖/復氧復糖造模制備，直至細胞培養結束；E組：加入等量的無菌DMSO，處理方法與B組同；F組：用Bax抑制劑Bax inhibitor peptide V5預處理后，再進行缺氧缺糖/復氧復糖，直至細胞培養結束；G組：用Bax激動劑(BAM7)預處理后，再進行缺氧缺糖/復氧復糖，直至細胞培養結束；H組：用Bax inhibitor peptide V5預處理，而后加入黃芪注射液，再進行缺氧缺糖/復氧復糖，直至細胞培養結束；I組：用BAM7預處理，而后加入黃芪注射液，再進行缺氧缺糖/復氧復糖，直至細胞培養結束。神經細胞氧糖剝奪30 min后，分別復氧0.5、2、6、24、48、72、120 h。

1.2.3 指標測定 分別采用免疫組化法和RT-PCR法對復氧復糖后0、0.5、2、6、24、72、120 h的Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA的表達進行檢測和比較。免疫組化SP法具體操作按照試劑盒說明書進行(試劑盒購于北京中杉金橋公司)。RT-PCR法：收集細胞，采用TRIzol一步法將RNA提取出來，依據ExscriptTM RT reagent kit說明將RNA逆轉錄為cDNA。Caspase-3 cDNA引物序列下游5′-CAAAGCCAGTGGCACTCATTCTC-3′，上游5′-TGCGGCGTTACACGACCTT-3′，擴增片段長度為200 bp。內參照物β-actin的引物序列下游5′-ACATCTGGTGGAAGGTGGAC-3′，上游5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′，擴增片段長度為509 bp。按照PCR Amplificationkit說明進行反應，擴增條件：95℃預變性3 min，94℃ 40 s，54℃ 40 s，72℃ 40 s，循環30次，72℃終末延伸3 min。給予PCR產物采用質量分數1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，以β-actin為內參照重復試驗6次。采用凝膠分析軟件Quantity one進行半定量分析，目的條帶在200 bp位置。兔抗大鼠NSE多克隆抗體依照1∶50的比例稀釋，陽性細胞質和凸起呈棕黃色，胞核內含有少量黃色顆粒。使用M1VNT圖像分析系統對免疫組化陽性結果進行半定量分析。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行方差分析法和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 NSE蛋白的表達 A組大鼠海馬神經胞體飽滿，突起明顯，且突起的末端分支形成相互支持生長的神經網絡，神經膠質細胞數量較少，5個400倍視野中有72個陽性神經細胞，純度為(91.48±0.72)%。見圖1。

2.2 各組各時間點Bcl-2水平比較 0 h時點A、B、C、D、E、F、G、H、I組Bcl-2水平分別為0.368±0.04，0.370±0.03，0.365±0.02，0.369±0.03，0.382±0.04，0.369±0.04，0.371±0.03，0.382±0.04，0.368±0.03，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組除0 h各時間點的Bcl-2水平均高于A組，且各組均隨時間延長而增高，2 h達到頂峰。除0 h各時間點H組Bcl-2水平均顯著高于其他組(P<0.05)，其次為F組、D組、I組、G組、E組、B/C組、A組，且B組與C組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖1 NSE蛋白表達(×400)

組別0.5h2h6h24h72h120hA組0.352±0.040.371±0.020.366±0.050.370±0.030.358±0.040.349±0.02B組0.536±0.041)0.630±0.021)0.583±0.031)0.539±0.021)0.486±0.051)0.404±0.031)C組0.553±0.041)0.625±0.041)0.572±0.021)0.543±0.041)0.475±0.031)0.386±0.041)D組0.573±0.021)2)3)0.681±0.031)2)3)0.631±0.051)2)3)0.571±0.011)2)3)0.521±0.021)2)3)0.395±0.031)2)3)E組0.527±0.031)2)3)4)0.648±0.031)2)3)4)0.579±0.031)2)3)4)0.542±0.021)2)3)4)0.491±0.041)2)3)4)0.412±0.041)2)3)4)F組0.583±0.041)2)3)4)0.693±0.031)2)3)4)0.648±0.041)2)3)4)0.593±0.041)2)3)4)0.563±0.031)2)3)4)0.455±0.021)2)3)4)G組0.534±0.031)2)3)4)5)0.652±0.041)2)3)4)5)6)0.624±0.021)2)3)4)5)6)0.556±0.041)2)3)4)5)6)0.483±0.031)2)3)4)5)6)0.395±0.031)2)3)4)5)6)H組0.618±0.051)2)3)4)5)6)0.728±0.041)2)3)4)5)6)0.649±0.051)2)3)4)5)6)7)0.611±0.031)2)3)4)5)6)0.583±0.041)2)3)4)5)6)0.467±0.031)2)3)4)5)6)I組0.564±0.031)2)3)4)5)6)7)8)0.671±0.021)2)3)4)5)6)7)8)0.613±0.031)2)3)4)5)6)7)8)0.564±0.031)2)3)4)5)6)7)8)0.512±0.041)2)3)4)5)6)7)8)0.410±0.031)2)3)4)5)6)7)8)

與A組比較:1)P<0.05；與B組比較:2)P<0.05；與C組比較:3)P<0.05；與D組比較:4)P<0.05；與E組比較:5)P<0.05；與F組比較:6)P<0.05；與G組比較:7)P<0.05；與H組比較:8)P<0.05，下表同

2.3 各組各時間點Bax水平比較 0 h時點A、B、C、D、E、F、G、H、I組Bax水平分別為0.443±0.04，0.430±0.06，0.432±0.05，0.429±0.03，0.428±0.05，0.419±0.04，0.419±0.04，0.421±0.04，0.427±0.05，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組除0 h各時間點的Bax水平均低于A、B組，且各組均隨時間延長而增高，6 h達到頂峰。除0 h各時間點B組Bcl-2水平均顯著高于其他組(P<0.05)，其次為E組、G組、I組、D組、F組、H組，且B組與C組各時間點比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.4 各組各時間點Caspase-3 mRNA陽性神經元百分率比較 0 h時點A、B、C、D、E、F、G、H、I組Caspase-3 mRNA陽性神經元百分率分別為(3.762±0.83)%，(3.479±0.83)%，(3.173±0.83)%，(3.249±0.74)%，(3.573±0.81)%，(3.482±0.39)%，(3.729±0.92)%，(3.684±0.84)%，(3.572±0.83)%，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。各組除0 h各時間點Caspase-3 mRNA陽性神經元百分率均高于A組，且各組均隨時間延長而增高，24 h達到頂峰。除0 h各時間點B組Caspase-3 mRNA陽性神經元百分率均顯著高于其他組(P<0.05)，其次為E組、G組、I組、D組、F組、H組，且B組與C組各時間點比較無顯著差異(P>0.05)。見表3。

組別0.5h2h6h24h72h120hA組0.413±0.040.452±0.020.422±0.050.448±0.030.437±0.060.408±0.03B組0.730±0.041)0.880±0.031)0.965±0.021)0.795±0.051)0.644±0.061)0.514±0.021)C組0.728±0.061)0.875±0.041)0.972±0.031)0.810±0.021)0.639±0.051)0.621±0.041)D組0.655±0.041)2)3)0.735±0.031)2)3)0.802±0.041)2)3)0.693±0.031)2)3)0.576±0.041)2)3)0.468±0.051)2)3)E組0.718±0.051)2)3)4)0.894±0.041)2)3)4)0.973±0.021)2)3)4)0.782±0.041)2)3)4)0.652±0.041)2)3)4)0.521±0.031)2)3)4)F組0.628±0.031)2)3)4)5)0.714±0.051)2)3)4)0.784±0.041)2)3)4)5)0.671±0.041)2)3)4)5)0.609±0.031)2)3)4)5)0.439±0.041)2)3)4)5)G組0.703±0.041)2)3)4)5)6)0.884±0.051)2)3)4)5)6)0.961±0.031)2)3)4)5)6)0.773±0.051)2)3)4)5)6)0.638±0.051)2)3)4)5)6)0.517±0.041)2)3)4)5)6)H組0.601±0.041)2)3)4)5)6)7)0.702±0.041)2)3)4)5)6)7)0.749±0.031)2)3)4)5)6)7)0.654±0.031)2)3)4)5)6)7)0.584±0.051)2)3)4)5)6)7)0.417±0.031)2)3)4)5)6)7)I組0.692±0.031)2)3)4)5)6)7)8)0.871±0.041)2)3)4)5)6)7)8)0.948±0.021)2)3)4)5)6)7)8)0.751±0.021)2)3)4)5)6)7)8)0.618±0.041)2)3)4)5)6)7)8)0.502±0.031)2)3)4)5)6)7)8)

組別0.5h2h6h24h72h120hA組4.773±0.733.821±0.734.657±0.818.367±0.928.437±0.853.826±0.83B組6.178±0.841)34.629±7.371)43.758±9.371)74.375±11.271)41.736±7.371)8.369±0.921)C組5.739±0.891)39.249±9.281)42.479±9.241)68.384±13.211)41.369±8.161)7.936±1.151)D組5.863±0.931)2)3)14.379±10.371)2)3)36.274±8.371)2)3)47.840±12.171)2)3)17.374±7.221)2)3)3.274±0.731)2)3)E組6.026±0.731)2)3)4)30.379±8.271)2)3)4)39.279±9.141)2)3)4)71.378±10.361)2)3)4)38.479±7.191)2)3)4)8.037±0.841)2)3)4)F組5.480±0.821)2)3)4)11.389±9.481)2)3)4)27.479±9.281)2)3)4)35.280±13.281)2)3)4)13.479±8.371)2)3)4)2.946±0.771)2)3)4)G組5.936±0.661)2)3)4)5)6)23.368±9.371)2)3)4)5)6)38.479±9.371)2)3)4)5)6)64.375±12.471)2)3)4)5)6)34.279±9.181)2)3)4)5)6)7.649±1.111)2)3)4)5)6)H組5.148±0.741)2)3)4)5)6)7)9.364±8.941)2)3)4)5)6)7)24.360±9.161)2)3)4)5)6)7)31.368±11.341)2)3)4)5)6)7)11.378±7.361)2)3)4)5)6)7)2.748±0.931)2)3)4)5)6)7)I組5.916±0.831)2)3)4)5)6)7)8)19.379±9.211)2)3)4)5)6)7)8)37.279±9.111)2)3)4)5)6)7)8)57.369±11.361)2)3)4)5)6)7)8)26.379±8.171)2)3)4)5)6)7)8)5.375±0.931)2)3)4)5)6)7)8)

3 討 論

缺血性腦血管疾病發病的重要病理生理緩解為腦缺血后的再灌注損傷，通過誘導細胞凋亡引起神經元死亡。臨床上腦缺血/再灌注損傷的主要表現形式為缺氧缺糖/復氧復糖所造成的神經細胞損傷。有研究表明〔4〕，線粒體是有氧呼吸產生能量的主要場所，因而真核細胞凋亡的過程中線粒體發揮著樞紐作用，在神經細胞凋亡的控制中線粒體通路發揮著決定性作用。因而通過對分布在線粒體核膜、外膜、內質網膜上的Bcl-2家族蛋白的釋放進行調控能夠對細胞凋亡進行控制。

Bcl-2是Bcl基因家族中第一個被確認的能對抗細胞凋亡的基因，具有抑制細胞凋亡和延長細胞壽命的功能，經研究發現〔5〕，Bcl-2基因主要是通過阻斷細胞凋亡的公共信號傳導通路來實現抗細胞凋亡作用的。Bcl-2可通過阻滯線粒體釋放細胞色素(Cyt)-C、凋亡誘導因子(AIF)，或通過作用于聚二苯二甲酯酸(PTP)的有關蛋白阻止PTP的開放，維持線粒體內膜跨膜電位，發揮抑制細胞凋亡的功能〔5〕。Bax是 Bcl-2基因家族中最主要的促凋亡基因，多以非活性單體形式分布于胞質中，只有在接收到凋亡信號刺激后，發生分子構象改變，移位并插入線粒體外膜后形成Bax/Bax同源二聚體蛋白通道，破壞線粒體膜的完整性，致使Cyt-C釋放入細胞中，與胞質內的凋亡蛋白酶活化因子(Apaf)-1和Caspase-9酶原形成復合物并相互作用，進而激活Caspase蛋白酶系統，引發一系列級聯反應，產生凋亡信號，促進凋亡的發生〔6〕。Gibson等〔7〕發現，Bax基因能夠促進凋亡蛋白的釋放以及Caspase級聯反應的激活，保護缺氧缺血的細胞。Hara 等〔5〕觀察了沙土鼠短暫前腦缺血 5 min再灌注 48、72、96 h及7 d后，發現 Bax 的表達隨再灌注時間的延長而增加，至 72 h達頂峰，96 h立即消失。Chen等〔8〕通過血管阻斷法造成大鼠全腦缺血模型，在海馬 CA1 區，Bax mRNA 和蛋白質表達均明顯增多，由此可支持這樣的假說：Bax 可能是導致神經元凋亡的原因。Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，共同參與了Bax依賴性的線粒體細胞外膜通透性的調節，因而決定細胞存亡的關鍵是細胞內兩種對立蛋白間的比率〔9〕。研究發現，通常情況下Bcl-2和Bax兩種蛋白的表達量相對穩定，而當Bax在細胞內超表達時，Bax/Bax同源二聚體的數量明顯增多，細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡〔8〕；而當Bcl-2高表達時，則Bax/Bax二聚體大量解離，生成更為穩定的Bcl-2/Bax異源二聚體，對抗其誘導凋亡的作用，使細胞存活期延長。黃芪具有益氣固表、補氣生陽、抗毒生肌的功能，藥理學研究結果顯示，黃芪因其復雜的成分而具有多種多樣的生理活性，其能夠顯著提高腦缺血/再灌注大鼠腦組織內超氧化物歧化酶、一氧化氮、一氧化氮合酶的含量，清除氧自由基，增加微循環灌注，進而減輕腦缺血/再灌注損傷。因而以黃芪提取液作為主要成分的黃芪注射液因其具有扶正祛邪、益氣養元、健脾利濕、養心通脈的功效而被廣泛應用于對缺血性腦血管疾病的治療中〔10〕。本研究結果說明，黃芪注射液能夠通過抑制Bax的表達來抑制缺氧缺糖/復氧復糖大鼠海馬神經元的凋亡。因而推測，黃芪注射液對缺血性腦血管疾病作用的靶點為抑制Bax蛋白表達，但該推論仍需要進行進一步驗證。

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〔2016-12-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

河北省教育廳青年基金項目(No.Q2012002)；承德醫學院自然科學研究計劃項目(No.Q201506)；河北省高校重點學科建設項目資助(冀教高〔2013〕4號病理學與病理生理學)

1 河北中醫學院 2 河北省人民醫院

高維娟(1966-)，女，教授，主要從事腦血管病發病機制及中醫藥防治。

董雅潔(1980-)，女，主治醫師，碩士，主要從事腦血管病發病機制及中醫藥防治。

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A

1005-9202(2017)07-1608-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.017