慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺組織中IL-10、TNF-α及IFN-γ的表達(dá)及意義

鄭少?gòu)?qiáng) 劉德綱

(南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

慢性阻塞性肺疾病大鼠血清和肺組織中IL-10、TNF-α及IFN-γ的表達(dá)及意義

鄭少?gòu)?qiáng) 劉德綱1

(南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

目的 研究慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠血清和肺組織中白細(xì)胞介素(IL)-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α及γ-干擾素(IFN-γ)的表達(dá)及意義。方法 8周齡SD大鼠70只，根據(jù)數(shù)字隨機(jī)表法分成觀察組以及對(duì)照組各35只，將觀察組大鼠制成COPD模型，對(duì)照組則常規(guī)預(yù)處理，對(duì)比兩組血清以及肺組織的IL-10、TNF-α及IFN-γ水平，檢測(cè)肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)和平均肺泡數(shù)(MAN)、肺泡腔的面積與總面積的比值(PAA)氣道阻力和肺順應(yīng)性等肺功能指標(biāo)。結(jié)果 觀察組的血清和肺組織的IL-10及IFN-γ水平均明顯低于對(duì)照組，TNF-α水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。觀察組的MLI、PAA及氣道阻力水平明顯高于對(duì)照組，MAN及肺順應(yīng)性水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；COPD大鼠的IL-10和IFN-γ分別與MLI、PAA及氣道阻力呈負(fù)相關(guān)，與MAN及肺順應(yīng)性呈正相關(guān)；TNF-α分別與MAN及肺順應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)，與MLI、PAA及氣道阻力呈正相關(guān)(均P<0.05)。結(jié)論 COPD大鼠的血清及肺組織的IL-10及IFN-γ水平明顯降低，而TNF-α水平明顯上升，炎癥反應(yīng)與肺功能之間具有十分緊密的關(guān)聯(lián)。

慢性阻塞性肺疾病；IL-10；TNF-α；IFN-γ

慢性阻塞性肺疾病(COPD)為以氣流阻塞作為疾病特征的慢性支氣管炎以及肺氣腫，如未得到有效治療，可發(fā)展成肺心病甚至呼吸衰竭的一種臨床高發(fā)慢性病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，該病和有害性氣體以及有害性顆粒等引起的異常炎癥反應(yīng)密切相關(guān)〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)，COPD整個(gè)病情發(fā)展過(guò)程中，患者外周氣道以及肺實(shí)質(zhì)中腫瘤壞死因子(TNF)-α及γ-干擾素(IFN-γ)等水平均出現(xiàn)異常表達(dá)，說(shuō)明炎性因子可能和患者氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)有一定關(guān)聯(lián)，進(jìn)而影響到肺功能〔2，3〕。本研究擬分析COPD大鼠血清和肺組織中白細(xì)胞介素(IL)-10、TNF-α及IFN-γ的表達(dá)及意義。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇2016年9月1～30日在我院實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)的8周齡SD大鼠70只作為研究對(duì)象，均為雄性，體重180～230 g，平均(212.58±15.74)g。大鼠所在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的環(huán)境參數(shù)設(shè)置：(1)恒溫22℃～26℃；(2)恒濕40%～70%；(3)換氣次數(shù)為10～20次/h；(4)正向的梯度壓差為20～50 Pa；(5)工作照度為150～300 Lux；(6)動(dòng)物照度為15～20 Lux；(7)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)噪聲值<60 DB。根據(jù)數(shù)字隨機(jī)表法將大鼠分成觀察組以及對(duì)照組各35只，其中觀察組大鼠體重180～220 g，平均(211.97±10.26)g。對(duì)照組大鼠體重190～230 g，平均(213.05±12.52)g。兩組大鼠的性別及體重?cái)?shù)據(jù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?分組后為觀察組大鼠建立COPD模型，分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第1天及第15天，對(duì)兩組大鼠應(yīng)用濃度為10%的水合氯醛(產(chǎn)自廣州化學(xué)試劑廠)進(jìn)行腹腔注射式麻醉，并對(duì)觀察組大鼠氣道中緩慢注射0.2 ml脂多糖(產(chǎn)自美國(guó)的Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)為L(zhǎng)2880)，其含量為200 μg，而對(duì)照組僅給予注射0.2 ml生理鹽水。操作完成后需將兩組大鼠均各自放回飼養(yǎng)籠內(nèi)，給予正常食水飼養(yǎng)。在對(duì)觀察組進(jìn)行手術(shù)當(dāng)天不對(duì)該組大鼠進(jìn)行煙熏，其他時(shí)間需將觀察組大鼠放置在自行設(shè)計(jì)制作的染箱內(nèi)，每天9：00-10：30以及15：00～16：30兩個(gè)時(shí)間段實(shí)施被動(dòng)吸煙操作，每次燃燒香煙量為5支，單次煙熏時(shí)間需持續(xù)半小時(shí)，待20 min后殘留煙霧散去后進(jìn)行再次被動(dòng)吸煙。煙熏后需將大鼠放置回原飼養(yǎng)籠，并進(jìn)行正常食水飼養(yǎng)，持續(xù)4 w。對(duì)照組大鼠則不接受煙熏處理，僅正常飼養(yǎng)。

1.2.2 大鼠肺功能及炎癥因子等指標(biāo)的檢測(cè) 在煙熏結(jié)束后的次日，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠行4 ml/kg 10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，而后備皮并暴露出氣管，通過(guò)產(chǎn)自美國(guó)Buxco公司的RC肺功能檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)兩組大鼠的氣道阻力及肺順應(yīng)性進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)完成后提取大鼠的下腔靜脈血約3 ml，并置于真空抗凝管內(nèi)保存，而后給予3 000 r/min離心15 min，提取血清，檢測(cè)白IL-10、TNF-α以及IFN-γ水平。再稱取大鼠約100 mg的肺組織，置入玻璃研磨器內(nèi)，添加9倍4℃下的PBS液，待充分勻漿之后將其制作成10%的勻漿液，再放于4℃下進(jìn)行10 min 3 000 r/min的低溫離心，提取上清液檢測(cè)肺組織的IL-10、TNF-α以及IFN-γ的水平。

1.2.3 MLI、MAN及PAA的檢測(cè) 提取大鼠右下葉肺組織，經(jīng)10%甲醛固定之后，制成石蠟包埋切片，利用顯微鏡在相同放大倍數(shù)(10×20)和電壓下觀察，為每張切片選擇上、中、下、左、右等視野，通過(guò)Spot Cool CCD軟件實(shí)施圖像采集，而后利用IMAGE-Pro plus 4.1圖像分析系統(tǒng)分別檢測(cè)肺平均內(nèi)襯間隔(MLI)和平均肺泡數(shù)(MAN)以及肺泡腔的面積與總面積的比值(PAA)。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比兩組血清以及肺組織的IL-10、TNF-α及IFN-γ水平，MLI、MAN、PAA及氣道阻力和肺順應(yīng)性等肺功能指標(biāo)，分析COPD大鼠的IL-10、TNF-α及IFN-γ與MLI、MAN、PAA及肺功能的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析應(yīng)用Spearman法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組IL-10、TNF-α及IFN-γ水平對(duì)比 觀察組血清和肺組織的IL-10及IFN-γ水平均明顯低于對(duì)照組，TNF-α水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 兩組MLI、MAN、PAA及肺功能的對(duì)比 觀察組的MLI、PAA及氣道阻力水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，MAN及肺順應(yīng)性水平明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

組名IL-10(ng/L)血清肺組織TNF-α(pg/ml)血清肺組織IFN-γ(ng/L)血清肺組織觀察組43.84±9.2163.72±9.19112.52±30.47142.84±17.65645.76±21.54671.69±25.77對(duì)照組76.88±10.2394.12±8.5570.84±10.2580.29±9.42906.82±138.53982.51±126.90t/P值14.200/0.00014.328/0.0007.670/0.00018.497/0.00011.016/0.00014.201/0.000

組名MLI(×10-6m)MAN(×106個(gè)/m2)PAA(%)氣道阻力(kPa·ml-1·s-1)肺順應(yīng)性(ml/cmH2O)觀察組97.84±11.2695.87±14.8664.29±5.630.49±0.060.37±0.05對(duì)照組47.18±2.96164.38±9.3244.17±2.510.29±0.430.53±0.04T值25.74323.10719.3102.72514.783P值0.0000.0000.0000.0080.000

2.3 相關(guān)性分析 依照Spearman法分析相關(guān)性可知，COPD大鼠的IL-10和IFN-γ分別與MLI、PAA及氣道阻力呈負(fù)相關(guān)(rIL-10=-0.724、-0.617、-0.633；rIFN-γ=-0.588、-0.625、-0.720；均P<0.05)，與MAN及肺順應(yīng)性呈正相關(guān)(rIL-10=-0.679、0.705，rIFN-γ=0.636、0.683，均P<0.05)；TNF-α分別與MAN及肺順應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.712、-0.598，均P<0.05)，與MLI、PAA及氣道阻力呈正相關(guān)(r=0.654、0.731，均P<0.05)。

3 討 論

臨床研究已證實(shí)，COPD為能夠預(yù)防與治療的一種臨床常見(jiàn)病，其氣流受限癥狀呈進(jìn)行性發(fā)展，且和氣道以及肺等因有毒性氣體或者顆粒等而發(fā)生的慢性炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈程度相關(guān)。且目前已經(jīng)公認(rèn)吸煙為導(dǎo)致COPD的最重要危險(xiǎn)因素，且吸煙和人體氣道高反應(yīng)性以及免疫能力受損、感染等頻率直接相關(guān)，長(zhǎng)期吸煙會(huì)誘發(fā)COPD〔4～6〕。整個(gè)COPD病程中，炎性細(xì)胞發(fā)生聚集并產(chǎn)生活化作用起到重要意義。究其原因發(fā)現(xiàn)，活化的炎性因子會(huì)對(duì)氣道造成損傷，并有發(fā)展成肺部疾病的危險(xiǎn)，因此，部分吸煙者會(huì)出現(xiàn)呼吸道中炎性因子水平上升情況〔7，8〕。

本文研究結(jié)果符合黃炎明等〔9，10〕的報(bào)道，提示COPD大鼠存在較為明顯的炎癥反應(yīng)。原因可能與COPD本身就屬于以氣流阻塞為主要特征的一類慢性支氣管炎或肺氣腫等因素有關(guān)。其中IL-10可發(fā)揮較好的抑制促炎因子的效果，可抑制呼吸道內(nèi)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞對(duì)炎性因子的分泌，進(jìn)而對(duì)氣道的炎癥反應(yīng)產(chǎn)生抑制，促使中性粒細(xì)胞不斷凋亡，最終加快了呼吸道炎癥物質(zhì)的清除。IFN-γ對(duì)氣道炎癥的調(diào)控具有重要的作用，其可阻滯氣道炎癥導(dǎo)致的肺纖維化進(jìn)程。TNF-α則主要參與到氣道炎癥形成時(shí)的有關(guān)中性粒細(xì)胞活化進(jìn)程，致使氣道黏膜中出現(xiàn)大量的中性粒細(xì)胞，最終加重炎癥癥狀，甚至致使氣道結(jié)構(gòu)重塑〔11〕。同時(shí)，觀察組的MLI、PAA及氣道阻力水平明顯升高，MAN及肺順應(yīng)性水平明顯降低，符合汪新龍等人〔12，13〕的報(bào)道，提示COPD大鼠的肺泡及肺功能已出現(xiàn)一定程度的異常。筆者認(rèn)為原因可能與COPD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。其中MLI可反映肺泡的平均直徑，PAA可反映出肺泡腔面積的占比情況，MAN則可反映出肺泡密度，而氣道阻力及肺順應(yīng)性則能較好地呈現(xiàn)出大鼠的肺功能狀態(tài)〔14〕。COPD大鼠的炎癥反應(yīng)與其肺功能之間具有十分緊密的關(guān)聯(lián)，筆者認(rèn)為，可能由于COPD中炎癥反應(yīng)及肺功能損害變過(guò)程之間必然存在著較大聯(lián)系，這和荊晶等〔15，16〕的結(jié)論類似。

1 朱錦琪，彭毅強(qiáng)，陳 垣，等.血必凈干預(yù)對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠體內(nèi)炎癥因子的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014；14(6)：1048-52.

2 Abd El-Kader SM，Al-Jiffri OH，Al-Shreef FM.Plasma inflammatory biomarkers response to aerobic versus resisted exercise training for chronic obstructive pulmonary disease patients〔J〕.Afr Health Sci，2016；16(2)：507-15.

3 于倩倩，劉 穎，藺紅靜，等.霧化吸入糖皮質(zhì)激素對(duì)慢性阻塞性肺疾病急性加重期炎癥介質(zhì)IL-8和TNF-α水平的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(1)：45-6.

4 Li J，Wu S，Tang H，etal.Long-term effects of acupuncture treatment on airway smooth muscle in a rat model of smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Acupunct Med，2016；34(2)：107-13.

5 強(qiáng)麗霞，李香順，趙婷婷，等.Abhd2與慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能和氣道炎癥的相關(guān)性研究〔J〕.國(guó)際呼吸雜志，2016；36(2)：104-7.

6 Kuzubova NA，Lebedeva ES，Dvorakovskaya IV，etal.Modulating effect of peptide therapy on the morphofunctional state of bronchial epithelium in rats with obstructive lung pathology〔J〕.Bull Exp Biol Med，2015；159(5)：685-8.

7 陳艷蓉，肖 瑤，劉 彥，等.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞在慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2016；36(9)：2078-80.

8 Wei J，F(xiàn)an G，Zhao H，etal.Heme oxygenase-1 attenuates inflammation and oxidative damage in a rat model of smoke-induced emphysema〔J〕.Int J Mol Med，2015；36(5)：1384-92.

9 黃炎明，熊 萍，左萬(wàn)里，等.辛伐他汀對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部及系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的影響〔J〕.中國(guó)臨床研究，2016；29(6)：730-3.

10 吳建軍，姜良鐸，張 偉，等.安肺益腎方對(duì)COPD大鼠血清IL-2、IFN-γ、IgA、IgG及脾淋巴細(xì)胞增殖的影響〔J〕.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2013；20(4)：357-8.

11 祁海燕，封繼宏，李美鳳，等.肺寧顆粒對(duì)COPD急性期大鼠的肺組織病理和血清中TNF-α、MIP-2水平的影響〔J〕.陜西中醫(yī)，2016；37(8)：1094-7.

12 汪新龍，劉朝暉，梁志科，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道炎癥與白細(xì)胞介素10的相關(guān)性研究〔J〕.中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2014；13(2)：143-4.

13 李飛飛，張愛(ài)珍，段鵬鵬.加味六君子湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠外周血腫瘤壞死因子-α白細(xì)胞介素-8含量及肺組織病理變化的影響〔J〕.中國(guó)藥物與臨床，2016；16(4)：492-4.

14 陳 燕，熊 英，李 玲，等.慢性阻塞性肺疾病模型大鼠細(xì)胞因子水平變化的研究〔J〕.中華疾病控制雜志，2015；19(8)：839-42.

15 荊 晶，高 振，李 爭(zhēng)，等.寒燥環(huán)境對(duì)慢阻肺大鼠氣道杯狀細(xì)胞分布及肺組織病理變化影響探討〔J〕.臨床心身疾病雜志，2016；22(z1)：413-4.

16 Matsson H，S?derh?ll C，Einarsdottir E，etal.Targeted high-throughput sequencing of candidate genes for chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.BMC Pulm Med，2016；16(1)：146.

〔2016-09-27修回〕

(編輯 李相軍)

1 南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院心胸外科

劉德綱(1985-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤方面的研究。

鄭少?gòu)?qiáng)(1985-)，男，碩士，住院醫(yī)師，主要從事肺部感染性疾病和慢性阻塞性肺疾病方面的研究。

R56

A

1005-9202(2017)07-1613-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.019