miR-425對膠質瘤細胞遷移與侵襲的影響

焦克平 趙玉梅 張曉敏

(甘肅省人民醫院干部病房神經內科，甘肅 蘭州 730000)

miR-425對膠質瘤細胞遷移與侵襲的影響

焦克平 趙玉梅 張曉敏1

(甘肅省人民醫院干部病房神經內科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討miR-425對人膠質細胞瘤U87細胞遷移與侵襲能力的影響。方法 利用Lipo2000轉染試劑體外瞬時轉染人膠質細胞瘤U87，將細胞分為實驗組(轉染miR-425 mimics)、抑制組(轉染miR-425 inhibitors)、空白組(無轉染)。Real-time PCR檢測細胞中miR-425表達；劃痕實驗檢測細胞的遷移距離，Transwell實驗檢測細胞的遷移以及侵襲能力，Western印跡檢測基質金屬蛋白(MMP)2、MMP9的表達水平。結果 與空白組相比，miR-425 mimics組miR-425表達明顯上調，約為空白組的8倍，細胞侵襲與遷移能力下降，MMP2、MMP9表達下降，miR-425 inhibitors組miR-425表達明顯下調，約為空白組的0.14倍，細胞侵襲與遷移能力顯著增強，MMP2、MMP9表達增強。結論 miR-425的表達水平與膠質瘤U87細胞的遷移與侵襲能力密切相關。

膠質瘤；miR-425；侵襲；遷移

膠質瘤具有發病率高、易復發等特點〔1〕。標準治療方案是手術切除聯合放療、化療，但膠質瘤的侵襲性生長已成為膠質瘤治療的一大障礙〔2〕。

Micro RNAs(miRNAs)廣泛存在于真核生物中，是一類具有調節功能，但不能被編碼的單鏈RNA，不僅是癌癥形成的促進子，還是其抑制子；還能通過多種分子機制調控腫瘤的侵襲與轉移能力，在調節腫瘤的形成和發展中發揮作用〔3〕。前期研究發現，miR-425的表達可能與膠質瘤的生物學功能有關，然而目前關于miR-425在膠質瘤方面的作用研究還很少。本研究擬探討在膠質瘤細胞株中轉染miR-425模擬物以及抑制物對細胞侵襲遷移的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 U87膠質瘤細胞購于中科院上海細胞研究所。miR-425模擬物和miR-425抑制物購自西安沃爾森生物技術有限公司。DMEM高糖細胞培養液，DMEM-FBS培養液購自美國Gibco公司，轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，Taqman MicroRNA Real-time PCR試劑盒購自美國Gene Copoeia公司，胰蛋白酶購自德國Miltenyi Biotec公司，紫外分光光度計購自上海美譜達儀器有限公司、實時定量PCR儀購自西安天隆科技有限公司。

1.2 膠質瘤細胞U87的培養 U87細胞用含10%胎牛血清的DMEM在5% CO2，37℃培養箱內培養3～4 d。細胞粘連后，用0.25%胰蛋白酶消化。然后根據實驗需要，按照鋪滿的要求3倍稀釋細胞，把細胞接種于不同的培養板中。

1.3 細胞轉染 將對數生長期的U87細胞接種于6孔板中。將Lipo 2000轉染試劑分別與20 μmol/L的miR-425 mimics和miR-425 inhibitors等體積混合后，室溫孵育15 min，加入6孔板，使用無血清培養基繼續培養6 h，之后換用10% FBS的DMEM繼續培養2 d。

1.4 Real-time PCR檢測miR-425的表達 使用miRNA抽提試劑盒的使用方法提取U87細胞的總RNA，并檢測RNA濃度。按照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄合成cDNA，將cDNA加入到Taqman MicroRNA Real-time PCR試劑盒，在實時PCR儀上進行定量檢測。并采用2-△△Ct方法分析miR-425在不同細胞中的相對表達水平。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 將轉染過24 h的細胞制成單細胞懸液，取200 μl懸液加入Transwell小室的上室，向小室的下室加入600 μl含胎牛血清的DMEM培養基，將小室置于37℃、5% CO2培養箱繼續培養，2 h后取出，進行固定、染色，放置在倒置顯微鏡下拍照并計數。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 當轉染24 h后取出6孔板，使用事先消毒處理過的加樣槍頭垂直在培養板中部及兩側劃3條平行直線。加入新鮮培養基后置于37℃、5% CO2培養箱繼續培養。劃痕后分別在24 h后進行觀察，并統計細胞的遷移距離。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 Transwell小室上室側鋪一層基質膠后，接種不含FBS的經過轉染24 h的細胞懸液，下室加入含FBS的完全培養基，將Transwell小室置于37℃、5% CO2培養箱中繼續培養12 h，并進行固定、染色，隨后放置于倒置顯微鏡下拍照并計數。每組細胞使用3個Transwell小室，在倒置顯微鏡下每個小室隨機選取5個視野進行計穿過基底膜的細胞數，并進行統計。

1.8 Western印跡檢測基質金屬蛋白酶(MMP)2、9活性 使用蛋白提取試劑盒提取轉染后細胞的總蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，100℃煮沸制備蛋白樣品。配置8%的蛋白膠，蛋白膠凝固后進行上樣，上樣時應保證每孔蛋白量一致，恒壓80 V電泳，待Marker跑出濃縮膠時，換用120 V電壓繼續電泳，直至溴酚藍跑出玻璃板。冰浴100 V進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉6 h，以MMP2、9抗體作為一抗，4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗之后常溫孵育1 h，TBST清洗纖維素膜3次，5 min/次。采用增強化學發光法(ECL)發光劑顯影，自動凝膠成像系統采集圖像。

1.9 統計學方法 使用GraphPad Prism 5軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 Real-time PCR檢測miR-425的相對表達 轉染miR-425 mimics的U87膠質瘤細胞中miR-425的表達水平(8.00±0.189)較空白組(1.00)顯著上升(P<0.01)，miR-425 inhibitors中miR-425的表達水平(0.14±0.162)顯著下降(P<0.01)。說明在U87細胞中成功轉染miR-425的mimics及inhibitors。

2.2 miR-425表達水平對U87細胞侵襲的影響 相對于對照組遷移細胞〔(150.90±5.83)個〕，miR-425 mimics組細胞侵襲能力顯著下降〔(76.87±5.42)個〕，miR-425 inhibitors組顯著上升〔(255.58±7.42)個〕(P<0.05)。說明高表達miR-425可以有效抑制U87細胞的侵襲。

2.3 miR-425表達水平對U87細胞遷移的影響 轉染miR-425 mimics后，與對照組〔(660.12±5.62)個，(0.67±0.02)cm〕相比，miR-425 mimics組細胞遷移率及遷移距離〔(30.60±4.32)個，(0.52±0.03)cm〕顯著下降，miR-425 inhibitors組〔(89.68±5.92)個，(0.95±0.02)cm〕顯著上升(P<0.05)。

2.4 miR-425表達水平對MMP2和MMP9蛋白表達的影響 轉染miR-425 mimics后，與對照組相比，miR-425 mimics組MMP2和MMP9蛋白表達下降，miR-425 inhibitors組表達上升。見圖1。

圖1 miR-425表達對MMP2和MMP9蛋白表達的影響

3 討 論

膠質瘤的難治愈性主要取決于它的侵襲與遷移〔4〕，膠質瘤細胞對周圍腦組織的侵襲性嚴重限制著治療的有效性，目前對膠質瘤的治療手段受到諸多限制〔5〕。

miRNAs是一類內源性非編碼的小分子RNA，長度約為18～25個核苷酸，能與特定的mRNA分子的3′UTR結合，阻礙mRNA的翻譯，甚至會導致mRNA降解。研究表明，miRNAs參與多種病理過程，還參與胚胎形成與發育過程〔6，7〕。近年來研究發現miRNAs的異常表達與特定腫瘤之間也存在相關性，部分miRNAs對腫瘤的形成發育有抑制作用〔8〕。本研究侵襲與遷移實驗顯示，U87中miR-425的表達量提高后穿過Transwell濾膜的細胞數明顯減少，且腫瘤細胞的遷移距離明顯變短，表明細胞侵襲與遷移能力均下降；相反下調miR-425表達后，穿膜細胞數目顯著增加，腫瘤細胞的遷移距離增加，表明細胞的侵襲與遷移能力增長。MMPs是一類鋅離子依賴蛋白酶〔9〕，在腫瘤的侵襲與遷移過程中起重要作用。研究發現MMP2和MMP9與膠質瘤的侵襲能力高度相關〔10，11〕。本研究表明miR-425的表達水平能調節膠質瘤細胞U87的侵襲、遷移能力，這種調節與腫瘤細胞中MMP2和MMP9蛋白的表達密切相關。

1 Dwyer CA，Bi WL，Viapiano MS，etal.Brevican knockdown reduces late-stage glioma tumor aggressiveness〔J〕.J Neurooncol，2014；120(1)：63-72.

2 廖 珩，魏 君，宋 鑫，等.老年腦膠質瘤患者術后心理狀況及其影響因素〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(23)：5971-2.

3 Berger F，Reiser MF.Micro-RNAs as potential new molecular biomarkers in oncology：have they reached relevance for the clinical imaging sciences〔J〕?Theranostics，2013；3(3)：943-52.

4 Song Y,Luo Q,Long H，etal.Alpha-enolase as a potential cancer prognostic marker promotes cell growth，migration，and invasion in glioma〔J〕.Mol Cancer，2015；13(1)：65.

5 Le Rhun EL，Taillibert S，Chamberlain MC.Anaplastic glioma：current treatment and management〔J〕.Expert Rev Neurother，2015；15(6)：601-20.

6 Adnot S，Amsellem V，Boyer L，etal.Telomere dysfunction and cell senescence in chronic lung diseases：therapeutic potential〔J〕.Pharmacol Therap，2015；153(10)：125-34.

7 Gonzlez-Gonzalez M,Rito-Palomares M.Application of affinity aqueous two-phase systems for the fractionation of CD133+ stem cells from human umbilical cord blood〔J〕.J Mol Recogn，2015；28(3)：142-7.

8 Bartonicek N，Maag JL，Dinger ME.Long noncoding RNAs in cancer：mechanisms of action and technological advancements〔J〕.Mol Cancer，2016；15(1)：43.

9 Bodin S，Mattioli E，Fr?hlich S，etal.Regulation der expression von MMPs und TIMPs nach transplantation von mesenchymalen stammzellen in rattenmodell der chronisch-toxischen Lebersch?digung〔J〕.Zeitschrift Für Gastroenterologie，2015；53(1)：377-90.

10 吳建珩，李曉輝，吳世陶，等.ARK5和MMP-2在人腦膠質瘤中的表達及其臨床意義〔J〕.中風與神經疾病雜志，2013；30(7)：594-7.

11 Christoffersson G，Vagesjo E，Giraud A，etal.A distinct subset of proangiogenic CD11b(+)/Gr-1(+)/CXCR4(+)/MMP-9(hi) neutrophils are recruited by VEGF-A to transplanted hypoxic tissue〔J〕.Eur J Clin Investig，2013；43(23)：9-9.

〔2016-12-13修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

1 云南省第二人民醫院神經內科

張曉敏(1977-)，女，主治醫師，主要從事腦血管疾病研究。

焦克平(1977-)，女，主治醫師，碩士，主要從事神經免疫性疾病研究。

R739.4

A

1005-9202(2017)07-1615-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.020