截斷型ApoE對β-淀粉樣蛋白代謝的影響

董 翔 常 庚 趙 莉 周慧玲

(大連醫科大學附屬第一醫院神經內科,遼寧 大連 116011)

截斷型ApoE對β-淀粉樣蛋白代謝的影響

董 翔 常 庚 趙 莉 周慧玲

(大連醫科大學附屬第一醫院神經內科,遼寧 大連 116011)

目的 探討截斷型(trauncated)載脂蛋白(Apo)E對β-淀粉樣蛋白代謝的影響。方法 對N2a細胞進行培養，利用pEGFP-ApoE4或pEGFP-T-ApoE4質粒進行轉染后制備條件培養基，利用熒光法檢測全長ApoE4和truncated-ApoE4與Aβ42的結合能力，并對與Aβ42結合復合物對SDS的穩定性進行檢測，利用熒光顯微鏡對truncated-ApoE4和全長ApoE4對影響N2a細胞結合和攝取Aβ42情況進行觀察。結果 當Aβ42濃度≤100 nmol/L時，truncated-ApoE4組熒光強度均低于全長ApoE4組；進行含SDS聚丙烯凝膠電泳時，兩組均在6 kD的位置處出現條帶，而在43 kD處的條帶明顯變窄，truncated-ApoE4組大約是原來的30%，ApoE4組大約為原來的55%，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；truncated-ApoE4組N2a細胞結合和攝取Aβ42數量均少于全長ApoE4組(P<0.05)。結論 truncated-ApoE4與Aβ42結合能力減弱，形成的復合物穩定性降低，可以顯著影響N2a細胞對Aβ42的結合和攝取作用，抑制truncated-ApoE4產生為AD預防和治療提供新的研究方向。

阿爾茨海默病；載脂蛋白E；截斷型ApoE；β-淀粉樣蛋白

阿爾茨海默病(AD)是最為常見的癡呆類型〔1，2〕，由于患者出現失憶、認知障礙、執行障礙、行為改變等神經退變性改變，給患者日常生活造成嚴重影響，而且導致患者死亡風險大為增加，同時，給家庭和社會帶來十分巨大的負擔〔3〕。目前，AD確切的誘發因素和病理作用機制尚未十分清楚。β-淀粉樣蛋白(Aβ)是腦中淀粉樣前體蛋白在β-分泌酶作用下的裂解產物，以Aβ40和Aβ42為主，且Aβ42具有更強的聚集、疏水和神經毒作用〔4〕，研究發現〔5〕，AD的主要病理改變是出現大量的腦淀粉樣沉淀，而Aβ是主要成分，Aβ在誘發AD發生和進展過程中發揮著至關重要的作用。載脂蛋白(Apo)E是星型膠質細胞表達的一種糖蛋白，對神經元修復和再生起重要作用，有研究指出〔6〕，ApoE4與腦淀粉樣沉淀共同存在，且ApoE4頻率與淀粉樣沉淀形成程度呈正比，同時，ApoE4能夠與Aβ形成復合物。截斷型(truncated)-ApoE4是ApoE4基因C末端272～299位氨基酸殘基被蛋白酶水解后的片段，研究表明〔7〕，AD患者老年斑大量存在的不是全長ApoE4，而是truncated-ApoE4。本研究對truncated-ApoE4對Aβ代謝影響進行探討，并分析truncated-ApoE4對N2a細胞結合和攝取Aβ的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 小鼠腦神經瘤細胞N2a購自上海信則生物，pEGFP-ApoE4和pEGFP-T-ApoE4由大連醫科大學基礎醫學院提供。抗載脂蛋白E購自美國Chemicon公司，Covance Beta Amyloid β-淀粉樣蛋白單克隆抗體購自美國Covance公司，HRP標記羊抗兔IgG和HRP標記兔抗羊IgG均購自美國Santa Cruz公司，TRITC標記山羊抗兔IgG購自美國Jackson公司，ECL底物發光顯色試劑盒購自上海遠慕生物，G-418和硫酸葡聚糖凝膠柱購自美國Gibco公司，β淀粉樣肽/Aβ42抗體購自瑞士Bachem公司，Lipofectamine2000轉染試劑盒和Opti-MEM購自美國Invitrogen公司，ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司，F-4500熒光分光光度計購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與質粒轉染 將N2a細胞用FBS培養基于37℃、5%CO2條件下用培養箱進行培養，2 d換液一次，細胞豐度達到80%左右時，用0.125%胰酶進行消化后，用于傳代或試驗。用OPTI-MEM將2.7 μg純化的pEGFP-ApoE4或pEGFP-T-ApoE4質粒稀釋至250 μl，取Lipofectamine2000 5 μl稀釋至250 μl，37℃下放置5 min，兩者進行混勻后，37℃靜置20 min后，加入到含OPTI-MEM 1.5 ml的含N2a細胞的6孔板中混勻，37℃培養6 h，換含FBS的完全培養基培養48 h，使用濃度為800 μg/ml G418進行篩選2 w，3 d換液一次。繼續用濃度為400 μg/ml G418進行篩選30 d，成熟細胞即為成功轉染的細胞。

1.2.2 truncated-ApoE4和全長ApoE4條件培養基的制備和純化 將成功轉染并表達truncated-ApoE4和全長ApoE4的N2a細胞分別置于250 ml培養瓶中，37℃、5%CO2條件下生長到80%細胞豐度時，用無血清培養基進行洗滌2次，并用無血清培養基進行預孵育2 h。用無血清培養基洗滌1次后，于無血清培養基中過夜培養。對培養基進行收集，保存在1 mmol/L EDTA+0.01%NaN3+10 mmol/L aprotinin+10 mmol/L benzamidine溶液中。每周進行2次收集，連續30 d。利用離心機采用2 000 r/min離心10 min，12 000 r/min離心20 min，并利用硫酸葡聚糖凝膠柱離子交換色譜法對全長ApoE4和truncated-ApoE4進行純化。

1.2.3 truncated-ApoE4和全長ApoE4與Aβ42的結合能力檢測 利用熒光法對全長ApoE4和truncated-ApoE4與Aβ42的結合能力進行檢測。取純化的全長ApoE4或truncated-ApoE4溶解于pH7.4的0.1 mol/L的Tris溶液中，分別制備成濃度為5 nmol/L的溶液，并檢測熒光強度。加入Aβ42使其終濃度分別為10、20、50、100、200和500 nmol/L，進行平衡25 min后，分別檢測其熒光強度。

1.2.4 truncated-ApoE4和全長ApoE4與Aβ42結合復合物對SDS穩定性檢測 取凍存條件培養基30 μl和Aβ42 3.4 μl加入1 μl Tris HCL緩沖液中進行混勻孵育2 h，分別制備ApoE4、truncated-ApoE4與Aβ42結合復合物。取一部分復合物在不含SDS聚丙烯凝膠板上進行電泳后轉膜，利用Covance Beta Amyloid β-淀粉樣蛋白1-16(6E10)單克隆抗體進行檢測；另取一部分在含有SDS聚丙烯凝膠板上進行電泳，檢測方法同上。

1.2.5 truncated-ApoE4和全長ApoE4對N2a細胞結合和攝取Aβ42影響檢測 取凍存條件培養基30 μl和Aβ42 3.4 μl加入1 μl Tris HCl緩沖液中進行混勻孵育2 h，①取35 μl混合液加入無血清培養基并定容至3 ml，在4℃條件下對N2a細胞進行孵育30 min，棄上清加入4%多聚甲醛進行固定，利用PBS沖洗3次，每次5～10 min，加入1∶200比例稀釋β淀粉樣肽/Aβ42抗體進行過夜孵育后，PBS沖洗3次，每次5～10 min，加入1∶50稀釋的TRITC標記山羊抗兔lgG室溫孵育2 h，PBS沖洗3次，每次5～10 min，甘油封片后，對細胞結合能力進行觀察。②取35 μl混合液加入無血清培養基并定容至3 ml，在37℃條件下對N2a細胞進行孵育60 min，棄上清加入4%多聚甲醛進行固定20 min，利用PBS沖洗3次，每次5～10 min，用含0.3%Triton X-100的PBS進行破膜5～10 min后，其余步驟同細胞結合能力檢測試驗。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析，χ2檢驗。

2 結 果

2.1 truncated-ApoE4、全長ApoE4與Aβ42結合能力情況 利用熒光法對truncated-ApoE4、全長ApoE4與Aβ42結合能力進行檢測， truncated-ApoE4和全長ApoE4均能與Aβ42以飽和方式進行結合，當Aβ42濃度≤100 nmol/L時，truncated-ApoE4組熒光強度均低于全長ApoE4組，見表1。

表1 不同Aβ42濃度下truncated-ApoE4組和ApoE4組熒光強度變化情況

2.2 truncated-ApoE4、全長ApoE4與Aβ42結合復合物對SDS穩定性 利用含SDS和不含SDS的聚丙烯凝膠對truncated-ApoE4、全長ApoE4與Aβ42結合復合物穩定性進行檢測，進行不含SDS聚丙烯凝膠電泳時，兩組均能夠在43 kD的位置進行凝聚，出現粗的凝聚條帶。當進行含SDS聚丙烯凝膠電泳時，兩組均在6 kD的位置處出現條帶，而在43 kD處的條帶明顯變窄，truncated-ApoE4組大約是原來的30%，ApoE4組大約為原來的55%，兩組差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

A：不含SDS聚丙烯凝膠電泳；B：含SDS聚丙烯凝膠電泳圖1 truncated-ApoE4、全長ApoE4與Aβ42結合復合物對SDS穩定性

2.3 truncated-ApoE4和全長ApoE4對N2a細胞結合和攝取Aβ42影響 由圖2A和圖2B可知，truncated-ApoE4組N2a細胞結合Aβ42數量顯著少于全長ApoE4組(P<0.05)；由圖3A和圖3B可知，truncated-ApoE4組N2a細胞攝取Aβ42數量顯著少于全長ApoE4組(P<0.05)。見圖2，圖3。

圖2 truncated-ApoE4和全長ApoE4對N2a細胞結合Aβ影響

圖3 truncated-ApoE4和全長ApoE4對N2a細胞攝取Aβ影響

3 討 論

研究表明〔8〕，老年斑、神經元缺失、神經纖維纏結等是AD主要病理改變。而Aβ是老年斑的重要組成成分，其在腦組織中過度表達、聚集和沉淀能夠加速老年斑的形成，從而加快AD病程進展〔9〕。ApoE是在神經元修復和再生起重要作用一種糖蛋白，能夠調節Aβ的代謝、聚集和沉淀，可以和Aβ結合成可溶性的復合物，并能抵抗SDS的變性作用，ApoE4是ApoE的一個亞型，能夠增加AD的患病風險，可能與其影響Aβ聚集沉淀有關〔10〕，truncated-ApoE4是ApoE 4是蛋白酶水解產物，有研究指出〔11〕，truncated-ApoE4在AD病程中的作用遠強于ApoE 4。本研究對truncated-ApoE4和ApoE 4對Aβ代謝作用，以及對N2a細胞結合和攝取Aβ的影響進行了系統探討，鑒于腦組織中Aβ以Aβ40和Aβ42為主要組成，且Aβ42具有更強的聚集、疏水和神經毒作用〔4〕。

本研究說明truncated-ApoE4與Aβ42結合能力顯著低于全長ApoE4的結合作用，truncated-ApoE4的結合產物對SDS變性作用顯著降低，出現了大量的游離Aβ42，并且游離的Aβ42進行了聚集，出現了凝聚條帶，提示游離的Aβ42更具有聚集的特性〔12〕。本研究顯示truncated-ApoE4可以影響N2a細胞對Aβ42的結合和攝取作用，進一步從分子水平上說明了truncated-ApoE4對Aβ42代謝的影響作用。

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〔2015-03-25修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

常 庚(1981-)，男，博士，副主任醫師，碩士生導師，主要從事癡呆研究。

董 翔(1975-)，男，博士，副主任醫師，主要從事腦血管病及癡呆研究。

R743

A

1005-9202(2017)07-1621-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.023