miR-34b在老年鼻咽癌組織中表達及對細胞增殖、侵襲的影響

鐘 玲

(中航工業成都363醫院，四川 成都 610041)

miR-34b在老年鼻咽癌組織中表達及對細胞增殖、侵襲的影響

鐘 玲

(中航工業成都363醫院，四川 成都 610041)

目的 探討miR-34b在老年鼻咽癌組織中表達及對細胞增殖、侵襲的影響。方法 選取初治原發性老年鼻咽癌患者83例，正常鼻咽黏膜組織40例作為對照組，培養人鼻咽癌CNE-2細胞株，根據轉染物不同將細胞分為miR-34b轉染組、陰性對照組和空白對照組，利用實時熒光定量PCR技術檢測老年鼻咽癌及對照組組織中miR-34b表達以及不同轉染組細胞中miR-34b表達，MTT比色法檢測不同轉染組細胞增殖能力，檢測細胞黏附能力，Transwell法檢測不同轉染組細胞侵襲能力。結果 老年鼻咽癌組織中miR-34b相對表達量為(0.64±0.09)，顯著低于對照組的(0.94±0.12)，差異有統計學意義(t=14.410，P<0.001)；miR-34b在老年鼻咽癌組織中相對表達量與臨床分期、T分期、N分期和淋巴結轉移有關(P<0.001)；miR-34b轉染組細胞中miR-34b相對表達量為(0.85±0.10)，顯著高于陰性對照組和空白對照組，分別為(0.52±0.08)和(0.50±0.07)，差異有統計學意義(F=243.329，P<0.001)；與陰性對照組和空白對照組相比，miR-34b轉染組細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)；miR-34b轉染組黏附細胞數顯著高于陰性對照組和空白對照組，而侵襲細胞數顯著低于陰性對照組和空白對照組(P<0.001)。結論 miR-34b在老年鼻咽癌組織中呈低表達，上調miR-34b表達可減少細胞增殖，增加細胞黏附能力，抑制細胞侵襲能力，有望成為提高鼻咽癌對放射治療敏感性的目的基因。

鼻咽癌；miR-34b；細胞增殖；侵襲能力

鼻咽癌作為我國頭頸部常見惡性腫瘤，好發于中老年人群，隨著我國人口老齡化加劇，老年鼻咽癌患病率不斷上升〔1〕。由于鼻咽癌發病位置隱匿、早期缺乏典型臨床癥狀，加之老年人群各項機體功能下降，往往合并多種慢性病，多數患者確診時已處于晚期，嚴重影響患者預后〔2〕。關于鼻咽癌發生機制尚未完全清楚，飲食、環境和EB病毒感染等多種因素都可能誘發鼻咽癌〔3〕。微小RNA(miRNA)作為廣泛存在于生物體內的高度保守的短小RNA，在調控多項生理和病理過程中發揮重要作用，miRNA表達異常與人類多種腫瘤發生密切相關〔4〕。miR-34b作為miR-34家族重要成員，在多種惡性腫瘤發生及進展中發揮重要作用〔5〕。本研究擬對miR-34b在老年鼻咽癌患者組織中表達進行分析，并通過轉染miR-34b處理，觀察其對人鼻咽癌CNE-2細胞株增殖、黏附及侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年3月至2015年4月在成都363醫院治療的初治原發性老年鼻咽癌患者83例，其中，男61例，女22例，年齡65～85〔平均(71.3±7.6)〕歲，均經病理學檢查確診，均為非角化未分化癌，均未接受放化療治療。臨床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期26例，Ⅲ期29例，Ⅳ期27例；T分期：T1+T2期44例，T3+T4期39例；N分期：N0+N1期57例，N2+N3期26例。選取正常鼻咽黏膜組織40例作為對照組，年齡65～86〔平均(70.4±7.2)〕歲，男27例，女13例，兩組患者性別、年齡等一般情況差異無統計學意義(P>0.05)。本研究通過醫院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和設備 Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Biomiga公司，逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒和LipofectamineTM2000轉染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，miR-34b、內參U6、miR-34b模擬物及陰性對照序列均由上海生工公司設計合成，人鼻咽癌CNE-2細胞株由美國ATCC提供，RPMI 1640培養基、胎牛血清(BSA)和G418試劑均購自美國Sigma公司，噻唑藍法(MTT)細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自南京森貝伽生物公司，Transwell小室購自美國Corning公司，人源纖維連接蛋白(Fn)購自美國Sigma公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 利用實時熒光定量PCR技術檢測老年鼻咽癌及對照組組織中miR-34b表達 取老年鼻咽癌及對照組組織，研磨后，加入細胞裂解液裂解，用Trizol總RNA提取試劑盒對組織中總RNA進行提取，利用紫外分光光度計對總RNA純度進行檢測，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。將總RNA逆轉錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。引物序列分別為：miR-34b：上游：5′-CAATCACTAACTCCACTGCC-3′；U6：上游：5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′，二者通用下游引物序列為：5′-AACATGTACAGTCCATGGATG-3′。PCR反應條件：95℃ 60 s，95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，連續進行38個循環，每個樣品均設三個平行反應復孔。以U6為參照，用2-△△Ct法獲得老年鼻咽癌及對照組組織中miR-34b相對表達量。

1.3.2 細胞培養及處理 將人鼻咽癌CNE-2細胞株培養于含10% BSA的RPMI 1640培養基中，于37℃、5% CO2條件下恒溫培養，穩定傳代后，取對數生長期細胞，按5×104/孔接種于6孔板中繼續培養至細胞融合度達到70%～80%。將細胞分為三組，利用LipofectamineTM2000轉染試劑盒對各組進行轉染：miR-34b轉染組：轉染miR-34b模擬序列：正義鏈：5′-CAAUCACUAACUCCACUGCCAU-3′，反義鏈：5′-GGCAGUGGAGUUAGUG AUUGUU-3′；陰性對照組：轉染陰性對照序列：正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3′；空白對照組：不做任何處理。轉染后各組細胞繼續進行培養。

1.3.3 利用實時熒光定量PCR技術檢測不同轉染組細胞中miR-34b表達 取各組轉染后培養48 h細胞，加入細胞裂解液進行裂解，其余方法同1.3.1。

1.3.4 MTT比色法檢測不同轉染組細胞增殖能力 取各轉染組細胞，接種于96孔板中，調整細胞密度為5×104/孔，每組均設置6個平行反應復孔，分別于轉染后24 h、48 h、72 h和96 h，將MTT液20 μl加入各孔，繼續培養4 h，將二甲基亞砜150 μl加入各孔，振蕩15 min，結晶充分溶解后，利用酶標儀對570 nm處光密度值(OD值)進行檢測。

1.3.5 細胞黏附能力檢測 將Fn稀釋液50 μl包被96孔板，于培養箱中處理120 min。將1% BSA 100 μl加入各孔，封閉120 min。取各組轉染后培養48 h細胞，胰酶消化后，調整細胞濃度為5×104/ml，加入各孔，于培養箱中培養60 min。將96孔板取出后，用甲醛固定15 min，用吉姆薩進行染色15 min。顯微鏡下觀察，隨機取5個視野，對黏附細胞進行計數。

1.3.6 Transwell法檢測不同轉染組細胞侵襲能力 取各組轉染后培養48 h細胞，胰酶消化后，調整細胞密度為5×104/ml。將50 μl Matrigel膠鋪于24孔板Transwell小室，培養箱中過夜。去200 μl細胞懸液加入小室上室，將培養液加入小室下室，于37℃恒溫培養箱中培養12 h，取出小室，將上室中的細胞輕輕擦去，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后，用結晶紫染色15 min。用顯微鏡進行觀察，隨機取5個視野，計數細胞數。

2 結 果

2.1 老年鼻咽癌及對照組組織中miR-34b表達比較 老年鼻咽癌組織中miR-34b相對表達量為(0.64±0.09)，顯著低于對照組的(0.94±0.12，t=14.410，P<0.001)。

2.2 miR-34b在老年鼻咽癌組織中表達與臨床病理特征之間的關系 miR-34b在老年鼻咽癌組織中相對表達量與年齡、性別無關(P>0.05)，而與臨床分期、T分期、N分期和淋巴結轉移有關(P<0.001)。見表1。

2.3 不同轉染組細胞中miR-34b表達比較 miR-34b轉染組細胞中miR-34b相對表達量為(0.85±0.10)，顯著高于陰性對照組和空白對照組，分別為(0.52±0.08)和(0.50±0.07)，差異有統計學意義(F=243.329，P<0.001)。

2.4 不同轉染組細胞增殖能力比較 根據不同轉染組細胞不同時點OD值，繪制細胞不同時點生長曲線，分析發現，與陰性對照組和空白對照組相比，miR-34b轉染組細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.5 不同轉染組細胞黏附能力和侵襲能力比較 miR-34b轉染組黏附細胞數顯著高于陰性對照組和空白對照組，而侵襲細胞數顯著低于陰性對照組和空白對照組(均P<0.001)。見表2，圖2，圖3。

指標nmiR-34b相對表達量t值P值年齡(歲)1.0070.158≥72500.62±0.07<72330.65±0.10性別0.0730.471男610.63±0.08女220.66±0.11臨床分期14.280<0.001Ⅰ+Ⅱ期270.71±0.08Ⅲ+Ⅳ期560.49±0.06T分期17.113<0.001T1+T2期440.81±0.14T3+T4期390.39±0.06N分期15.846<0.001N0+N1期570.77±0.10N2+N3期260.43±0.09淋巴結轉移16.101<0.001是470.41±0.07否360.78±0.12

圖1 不同轉染組細胞增殖能力比較

組別黏附細胞數侵襲細胞數miR-34b轉染組183.5±21.71)2)135.4±29.51)2)陰性對照組102.3±15.9218.6±33.9空白對照組107.6±16.8223.4±38.2F值350.063114.816P值<0.001<0.001

與空白對照組比較，1)P<0.05；與陰性對照組比較：2)P<0.05

圖2 不同轉染組細胞黏附能力比較

圖3 不同轉染組細胞侵襲能力比較

3 討 論

老年鼻咽癌發病率不斷增加，且受老年人機體生理功能下降的影響，多數患者確診時已處于中晚期，放療成為主要的治療手段，而放療近遠期效果與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲力等密切相關〔6〕。miRNA是一類長度約為20～25個核苷酸的非編碼小RNA，可通過結合于靶基因mRNA的3′非翻譯區而降解mRNA或抑制蛋白翻譯，從而實現在轉錄后水平上對基因表達的調控，與細胞增殖、分化及凋亡、器官形成、免疫反應等多種生物學過程密切相關〔7〕。研究表明，腫瘤發生及進展過程涉及多種miRNA表達異常。miR-34b作為miR-34家族重要成員，受P53直接轉錄調控，在抑制腫瘤增殖、分化中發揮重要作用〔8〕。在對多種惡性腫瘤研究時發現〔9〕，miR-34基因啟動子區甲基化導致miR-34表達下調甚至缺失，可使細胞周期及細胞凋亡失調，從而導致腫瘤發生。曹嵐等〔10〕研究發現，miR-34b啟動子區CpG島甲基化使白血病細胞株中miR-34b表達降低，而外源性導入miR-34b可抑制細胞增殖、轉移及侵襲能力。本研究顯示，miR-34b可能參與了老年鼻咽癌發生及進展過程，且在該過程中可能發揮抑癌基因的功能。

該研究結果說明，利用轉染miR-34b模擬物的方式可以上調CNE-2細胞中miR-34b表達，抑制CNE-2細胞增殖，進一步提示miR-34b可能在鼻咽癌發生中發揮抑癌基因功能〔11〕；上調miR-34b還可增加細胞黏附能力，而降低細胞侵襲能力，提示miR-34b可能在鼻咽癌發生、進展過程中發揮重要作用。

綜上，miR-34b在老年鼻咽癌組織中呈低表達，上調miR-34b表達可減少細胞增殖，增加細胞黏附能力，抑制細胞侵襲能力，有望成為提高鼻咽癌對放射治療敏感性的目的基因。

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〔2016-12-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

四川省衛計委基本醫學科研項目(No.110103)

鐘 玲(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事耳鼻喉疾病診斷與治療研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1668-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.043