PKM剪接體在伊馬替尼敏感及耐藥慢粒細胞中的差異表達

張靜，李書琪，姜鈺環，黃波，劉靜，徐顏美，林晉，王小中

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

·論著·

PKM剪接體在伊馬替尼敏感及耐藥慢粒細胞中的差異表達

張靜，李書琪，姜鈺環，黃波，劉靜，徐顏美，林晉，王小中

(南昌大學第二附屬醫院檢驗科，江西南昌330006)

目的探討丙酮酸激酶剪接體M1型（PKM1）和M2型（PKM2）在不同慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）細胞中的表達情況及意義。方法收集南昌大學第二附屬醫院確診的伊馬替尼(Imatinib，IM)敏感（n=23）和IM耐藥（n=7）CML患者外周血或骨髓，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）的方法檢測IM敏感CML細胞系K562、IM耐藥CML細胞系K562/G01及30例臨床樣本中PKM1和PKM2表達水平。結果與K562細胞相比，K562/G01細胞中PKM2/PKM1的比值明顯升高；IM耐藥CML患者PKM2/PKM1的比值較IM敏感者顯著上調。結論PKM發生異常剪接可能與CML細胞IM耐藥相關。

丙酮酸激酶；剪接體；慢性粒細胞白血病；伊馬替尼

伊馬替尼(Imatinib，IM)耐藥是CML治療失敗的主要原因之一，其耐藥機制十分復雜，主要包括bcr-abl融合基因的表達上調，藥理學改變等[1，2]。近年來，腫瘤細胞能量代謝異常導致化療抵抗的現象引起了研究熱點[3-5]。與正常細胞不同，腫瘤細胞即使是在氧氣供應充足的條件下也采用糖酵解的方式來分解葡糖糖并獲得能量的現象被稱之為有氧糖酵解。由于腫瘤細胞發生代謝重塑這一特殊表型是由德國生理學家Warburg教授首次發現，因此也被稱作Warburg效應。近期，研究者應用代謝組學技術對IM敏感與耐藥的CML細胞株進行代謝分析，發現升高的糖酵解活性與IM耐藥有關[6]，提示糖酵解可能在CML細胞IM耐藥形成中發揮了重要的作用。付偉等[7]應用GEO數據庫下載K562細胞和IM處理的K562細胞基因表達芯片數據，篩選得到重要差異表達核心基因包括PKM，表明PKM可能與CML細胞對IM抵抗密切相關。

1 材料與方法

1.1 研究標本的來源人CML細胞系K562細胞和IM耐藥細胞株K562/G01均為本實驗室保存。由于急變期CML幾乎對所有常規化療藥物均有抗性，因此我們選擇急變CML患者標本作為耐藥CML研究對象。根據《慢性髓性白血病治療專家共識（2010版）》[8]作為IM耐藥診斷標準，IM治療3個月未能達到完全血液學緩解，治療6個月未能達到細胞遺傳學緩解或治療12個月未能達到主要細胞遺傳學緩解，失去已經獲得的完全血液學緩解或細胞遺傳學緩解，疾病進展或出現耐藥的Bcr－Abl激酶突變。選取2016年6月至2016年12月期間于南昌大學第二附屬醫院確診的IM敏感的CML樣本23例和IM耐藥的CML標本7例。所有標本的使用符合南昌大學第二附屬醫院倫理委員會的倫理要求。

1．1．1主要試劑PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒（日本Takara公司），2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物技術有限公司）。

1．1．2儀器PCR基因擴增儀（美國BIO－RAD公司）

1．2方法

1．2．1 RT－PCR檢測PKM1和PKM2表達水平收集南昌大學第二附屬醫院確診的23例IM敏感和7例耐藥患者的外周血或者骨髓，提取RNA，逆轉錄生成cDNA，根據PKM1、PKM2、GAPDH基因設計特異引物，采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒檢測PKM1、PKM2的相對表達。引物序列見表1。

表1 PCR反應引物的序列

表2 IM敏感和IM耐藥CML細胞中PKM1、PKM2 mRNA灰度值

反應條件為：95℃5min；（95℃35s；退火溫度見表30s；72℃30s）35個循環；72℃5min；以GAPDH作為內參。反應結束后，取PCR產物10μl進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認PCR產物的大小是否與預測值相符合。

1．3統計學方法應用SPSS 22．0統計軟件進行數據統計與分析，正態計量數據以均數±標準差（x±s）形式表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1比較不同CML細胞株中PKM2/PKM1比值變化為了檢測IM敏感（NO．25）和耐藥CML細胞株（NO．24）中PKM1和PKM2 mRNA表達情況，采用RT－PCR方法對K562和K562/G01細胞中PKM2/ PKM1比值進行檢測。結果顯示，與K562細胞相比，K562/G01細胞中PKM2/PKM1比值呈上升趨勢（圖1）。

2．2比較IM敏感和耐藥的CML樣本中PKM2/ PKM1比值差異為了進一步驗證這一表達差異，我們收集了23例（NO．1－23）IM敏感CML樣本和7例（NO．26－32）IM耐藥的CML標本為研究對象，對其PKM1和PKM2 mRNA表達水平進行了灰度半定量檢測與分析，見表2。結果同樣發現，PKM2在IM耐藥CML患者中高表達，PKM2/PKM1比值較IM敏感CML患者顯著上調。

圖1 比較不同CML細胞中PKM2/PKM1比值變化

3 討論

IM已成為CML治療的一線治療選擇，然而伴隨出現的IM耐藥已成為CML治療的最主要障礙，其耐藥形成的具體機制仍不清楚。研究發現，IM抵抗與CML細胞的代謝途徑密切相關[7，9]。因此，能量代謝可能在CML耐藥機制中起著重要作用。腫瘤細胞在缺氧情況下進行糖酵解產能可使其適應缺氧環境，保持生長優勢。此外，腫瘤細胞糖酵解產生大量乳酸，可使腫瘤微環境改變，從而促進腫瘤的侵襲和轉移[10-12]。丙酮酸激酶（PK）是腫瘤進行有氧糖酵解的必要條件，其不同的剪接產物PKM1和PKM2活性與腫瘤糖酵解緊密相關，但PKM剪接產物的表達水平與血液腫瘤化療抵抗間的關系仍少見報道。

我們的研究結果顯示：PKM2在IM耐藥CML細胞中高表達，且PKM2/PKM1比值較IM敏感的CML細胞顯著上調。提示PKM2表達升高，促進CML糖酵解，進而導致CML耐藥現象。腫瘤細胞在缺氧條件下表現出葡萄糖利用增加，糖酵解增強的現象，通常認為該效應與缺氧誘導因子-1（HIF-1）相關，保證腫瘤細胞在無氧條件下的生存與增殖。研究報道，PKM2作為HIF-1的靶基因促進葡萄糖利用，降低氧耗；而PKM1缺乏缺氧反應元件，不能與HIF-1靶基因相互作用，難以滿足缺氧條件下CML細胞快速增殖需求[13-15]。綜上所述，PKM2促進了白血病細胞的代謝重編程，適應了白血病細胞過度增殖后能量代謝和合成代謝的需求，可能是IM耐藥CML細胞中PKM2增加而PKM1減少的原因之一。因此，PKM2/PKM1比值有望成為預測CML細胞是否對IM耐藥的潛在指標。

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Differencial expression of PKM spliceosomes in Imatinib sensitive and resistant CML cells

ZHANG Jing，LI Shuqi，JIANG Yuhuan，etal.Department of Clinical Laboratory，The Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanhcang 330006，China.

Objective To explore the expression levels and effects of the pyruvate kinase spliccesome PKM1 and PKM2 in different chronic myeloid leukemia(CML)cells.Methods CML patients diagnosed as imatinib(IM)sensitive(n=23)and IM resistant(n=7)were enrolled from the second affiliated hospital of Nanchang university，respectively.PKM1 and PKM2 mRNA levels were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)in IM sensitive cell line(K562)，IM resistant cell line (K562/G01)and 30 clinical samples.Results PKM2/PKM1 ratio was significantly higher in K562/G01 compared with that in k562；the PKM2/PKM1 ratio in IM resistant patient was also obviously higher than that in IM sensitive patient.Conclusion Aberrant splicing of PKM is probably related to Imatinib resistance in CML cells.

Pyruvate kinase；Splicesome；Chronic myeloid leukemia；Imatinib

R733.7，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0140-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.002

2017-03-06；

2017-03-21)

國家自然科學基金項目(編號81271912)

張靜，1990年生，女，南昌大學碩士研究生，主要從事血液病機制研究；李書琪，1993年生，女，南昌大學碩士研究生，主要從事血液病機制研究。張靜和李書琪為共同第一作者。

王小中，1973年生，男，教授，博士研究生導師，主要從事血液病機制研究；E-mail：wangxzlj@126.com。