江西人群CCL3L1基因拷貝數與HIV感染相關性研究

靳廷麗，劉麗萍，易志強，張娜，唐翼龍，丁晨，廖清華

(1、江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029；2、深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳518055)

江西人群CCL3L1基因拷貝數與HIV感染相關性研究

靳廷麗1，劉麗萍1，易志強1，張娜1，唐翼龍1，丁晨1，廖清華2

(1、江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029；2、深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳518055)

目的研究江西省HIV/AIDS（艾滋病感染者/艾滋病病人）人群趨化性細胞因子配體蛋白CCL3L1（CC chemokine ligand 3－like－1）的拷貝數及其與HIV病毒（艾滋病病毒）易感性及艾滋病進展的關系。方法收集192例HIV/AIDS和131例陽性者配偶陰性血樣標本，提取基因組DNA，應用PRT（the Paralogue Ratio Test）法檢測其CCL3L1基因拷貝數，計算江西省人群CCL3L1基因拷貝數中位數，用SPPS統計軟件分析CCL3L1拷貝數與HIV感染的關系。結果江西人群CCL3L1基因拷貝數中位數為2；HIV慢性感染者與健康人無顯著性差異（P＞0．05）；第一次CD4淋巴細胞數與基因拷貝數的變化有顯著相關(P＜0．05)。結論江西人群的CCL3L1基因拷貝數與HIV易感性無相關性，與感染進程有一定相關性。

江西；CCL3L1基因；艾滋病病毒；感染；相關性

CCL3L1蛋白是由CCL3L1基因編碼，它是一種強效化學趨化細胞因子，可以調節免疫、參與免疫細胞分化發育并介導炎癥反應，也是CCR5（HIV感染時主要輔助受體）的天然配體之一，據報道CCL3L1基因拷貝數量與HIV易感性和疾病進程有著重要的關系[1，2]，CCL3L1基因拷貝數在不同個體之間、不同地域的人種之間是有差異的，在同一區域的同一人種的CCL3L1基因拷貝數均圍繞其平均值呈分散分布。例如，HIV陰性的非裔美洲人CCL3L1基因拷貝數平均為4個，而歐裔美洲人該值為2個[3，4]，對中國漢族人群的報道數值有1～4不等[5－7]，本研究針對江西省人群的CCL3L1基因拷貝數與HIV病毒感染相關性進行研究。

1 材料與方法

1．1研究對象收集2011年及之前確診的HIV/ AIDS患者血樣192份，男性110例，女性82例，平均年齡40歲，均已抗病毒治療并排除合并肺結核感染。同時收集131份健康人群血樣，該人群為陽性者配偶，男性39例，女性92例，平均年齡為42歲。

1．2實驗方法

1．2．1基因組DNA提取按照QIAGEN試劑盒說明書提取DNA，提取的DNA濃度的測定利用NanoDrop－5000微量分光光度計，根據實際測量濃度值稀釋或濃縮至5ng/μl。CCL3L1基因擴增的引物選擇參考Gonzalez E等[3]CCL3AF－FAM：TCATA GTGGGTTCTCTGTTTC，CCL3AR：ATCCAGGGCTGCTTACTT，擴增條件37℃2min，95℃3min，預變性，94℃15s變性，60℃20s延伸，72℃20s，35個循環72℃10min 25℃1min反應結束后，制備瓊脂糖凝膠進行PCR產物鑒定，CCL3L1基因長度為220bp，內參CCL3為226bp。

1．2．2 PCR產物的處理及毛細管電泳分析將鑒定完成的PCR產物稀釋20倍，再分別將1μl稀釋后的PCR產物、1μl LIZ500分子量內標和8μl Hi－Di Formamide置于0．2ml單管中渦旋振蕩10s，2000 r/min分離心15s。將處理好的產物轉移到96孔自動進樣托盤上進行毛細管電泳（原理如圖1）。見圖2。

圖1 來源Walker e tal./Genomics 93(2009)98-103

圖2 CCL3A基因毛細電泳圖譜

1．3數據分析根據樣本DNA與內對照DNA擴增產物長度及熒光標記信息，利用GeneMarker V2．2．0對ABI3130測序儀生成的數據文件進行分析，輸出每個產物峰的峰面積值，輸出數據采用Excel進行處理分析。利用參照基因峰面積值（I）對目標基因峰面積值（S）進行校準后獲取目標基因的準確拷貝數。計算：CCL3L1基因拷貝數=目標基因拷貝數/參考基因拷貝數×2。計算出各樣本的CCL3L1基因拷貝數，用統計軟件分別計算HIV陽性者和陽性者配偶的基因拷貝數的中位數；從艾滋病綜合防治信息系統中查找出隨訪后第一次CD4淋巴細胞數和最近一次CD4淋巴細胞數，并計算CD4淋巴細胞數平均每月下降個數；采用SPSS21統計軟件分析數據，根據概率P＜0．05，判斷差異有統計學意義。

2 結果

2．1 HIV陽性者和陽性者配偶的基因拷貝數的中位數均為2。

表1 HIV陽性者和陽性者配偶的基因拷貝數情況

2．2 CCL3L1基因拷貝數與HIV易感性分析結果192名HIV/AIDS患者和131名健康的陽性配偶的CCL3L1基因拷貝數用中位數進行統計描述，用卡方檢驗CCL3L1基因拷貝數變異與HIV易感性的相關關系，差異無統計學意義。

表2 CCL3L1基因拷貝數與HIV易感性進行卡方檢驗分兩種情況

2．3 CCL3L1基因拷貝數與CD4淋巴細胞數每月CD4淋巴平均變化數與CCL3L1基因拷貝數做相關統計。分別將前后兩次的CD4淋巴細胞數均分為三組，分別為大于350個/μl，200～350個/μl和小于200個/μl，與CCL3L1拷貝數中位數進行統計描述，用Spearman相關分析CCL3L1基因拷貝數變異與CD4淋巴細胞數變化關系。結果是與第一次CD4淋巴細胞數有顯著相關性，與最近一次CD4細胞數結果及CD4細胞平均月下降數均無相關性。

表3 與第一次CD4淋巴細胞數的關系

表4 與第二次CD4淋巴細胞數的關系

表5 與平均每月CD4淋巴細胞數變化的關系

3 討論

CCL3L1基因位于17q的一個重復區域，該區域包括CCL3L1和CCL4基因，它們在不同個體間存在拷貝數的差異。其編碼的CCL3L1蛋白是CCR5的高親和性配體，可最有效地抑制HIV-1與CCR5結合進入細胞。早在2002年就有人提出CCL3L1基因拷貝數的變異可能會影響某些疾病的易感性和進程，但CCL3L1基因拷貝數與HIV-1感染的關系尚無定論。2004年Bugeja MJ等[8]首先對CCL3L1基因與HIV易感性、感染進程的影響進行了人群研究。發現CCL3L1基因拷貝數與HIV易感性、感染進程無關。

2005年Gonzalez E等[3]對不同地區和不同種族人群的CCL3L1基因拷貝數的分布進行了全面研究，以相應陰性人群的CCL3L1基因拷貝數的中位數為分界值，分析拷貝數與HIV感染易感性反應關系，發現其中高于中位數者，隨拷貝數的增加獲得HIV感染的危險性降低，而低于中位數者，隨拷貝數減少獲得HIV感染的危險性增高。這些結果顯示，CCL3L1基因的相對拷貝數與HIV易感性之間存在劑量反應關系，個體對HIV易感性的差異決定于其CCL3L1基因拷貝數在相應種族人群的相對水平，即相對拷貝數，此外，CCL3L1拷貝數低于人群拷貝數中位數者的HIV感染者發展為艾滋病或死亡病程更短，提示CCL3L1基因相對拷貝數可影響艾滋病的發展進程。

本研究針對江西人群CCL3L1基因拷貝數對HIV影響的關系，采用的方法是Armour JA等[9，10]建立的一種精確測量基因拷貝數的新方法-the Paralogue Ratio Test(PRT)，采用一對引物擴增出兩種產物，一種是目的基因產物，另外一種是參考基因產物，基因拷貝數通過他們的比值獲得，這種方法已經成功用于DEFB4基因拷貝數與牛皮癬的關系研究中[11，12]，并與Gonzalez E等[3]的檢測方法原理一致。本研究中陰性人群和陽性人群的CCL3L1基因拷貝數中位數均為2，采用人群的CCL3L1基因相對拷貝數中位數2為分界點進行統計分析，研究的結果得出HIV易感性與基因相對拷貝數無相關性。由于CD4淋巴細胞是艾滋病病毒侵犯的主要免疫細胞，本研究通過參照我省艾滋病感染人群的CD4淋巴細胞數的相關研究[13-15]來分析CCL3L1基因拷貝數對艾滋病進程影響，由于艾滋病常合并結核感染，為排除結核病對CD4淋巴細胞數的影響，我們收集血樣時已經排除了合并結核病的樣本。研究結果顯示相對拷貝數與第一次CD4淋巴細胞數呈正相關性，而與第二次CD4淋巴細胞數及平均月CD4淋巴細胞數變化均無相關性，考慮原因可能為第一次CD4淋巴細胞數檢測時均未開展抗病毒治療，而第二次是經過了抗病毒治療，而且治療時間長短不一，治療效果不一致，導致可比性降低，相比第一次CD4更有參考意義，由此提示CCL3L1基因相對拷貝數影響艾滋病進程。由于本研究樣本量較小，陽性者配偶者相對一般人群接觸艾滋病病毒的幾率更高，作為實驗陰性對照更有意義，但是不能排除部分陽性者配偶一直使用避孕套或者沒有性生活，因此和艾滋病病毒接觸機會就少，降低了陰性對照的可比性。我們得出的CCL3L1基因相對拷貝數與HIV易感性無相關性需進一步數據支持，進一步的研究需加大樣本量，并選定更具有參照意義的人群，收集更多的病程進展的指標如病毒載量作為參數等。本研究的成果為我們進一步研究奠定了重要基礎。

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Study of chemokine CCL3L1 gene copy number of people in Jiangxi province and its relationship with HIV-1 infection

JIN Tingli，LIAO Qinghua，LIU Liping，YI Zhiqiang ZHANG Na，TANG Yilong，DING Chen.Jiangxi Provincial Center for Disease Prevention and Control，Nanchang 330029，China.

Objective To study the chemokine CCL3L1 gene copy number of people in Jiangxi province and its relationship with HIV－1 infection．Methods Blood samples collected from the 192 cases of HIV/AIDS and 131 cases of HIV positive spouse who are HIV negative were used for the extraction of genomic DNA．The method of PRT(the Paralogue Ratio Test)was used to detect gene copy number of its CCL3L1，with that we calculated the median of CCL3L1 copy number in Jiangxi province．We investigated the relationship of CCL3L1 gene copy number with HIV by SPPS statistical software．Results The median of CCL3L1 copy number in Jiangxi province is two，and there is no statistical significant differences(P＞0．05)between the CCL3L1 copy number of HIV infected patients and that of healthy people．The first CD4 lymphocytes count after diagnosed is significantly correlated (P＜0．05)with CCL3L1 gene copy number．Conclusion The CCL3L1 gene copy numbers of people might not associate with the susceptibility to HIV but correlate with the progress of HIV/AIDS in Jiangxi．

Jiangxi；CCL3L1 HIV；Infection；Correlation

R512．91，R446．62

A

1674－1129(2017)02－0163－04

10．3969/j.issn.1674－1129．2017．02．008

2016-11-22；

2017-03-15)

江西省科技廳社會發展領域(20132BBG70098)

靳廷麗，1978年生，女，碩士，主管技師，主要從事艾滋病檢測與防制工作。Email:150225439@qq.com

廖清華，1972年生，主要從事艾滋病檢測與防制工作，Email：190898720@qq.com