2015年江西省麻疹疫苗株病毒的快速鑒別

龔甜，張艷妮，施勇，李健雄，周珺

(江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029)

2015年江西省麻疹疫苗株病毒的快速鑒別

龔甜，張艷妮，施勇，李健雄，周珺

(江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029)

目的運用逆轉錄多聚酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析方法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR-RFLP)快速鑒別2015年麻疹疫苗株病毒。方法用RT-PCR-RFLP方法檢測兩例疑似疫苗相關麻疹病例咽拭子標本是否含有AflⅡ酶切位點鑒別麻疹疫苗株病毒，同時對標本進行N基因羧基末端450個核苷酸進行序列測定分析，在基因層面進一步證實，以驗證RT-PCR-RFLP方法。結果RT-PCR-RFLP方法鑒定的結果為兩例疑似疫苗相關麻疹病例咽拭子標本均能被AflⅡ酶切開，N基因序列測定結果為兩例疑似疫苗相關麻疹病例咽拭子標本為麻疹疫苗株病毒A基因型。結論首次為江西省麻疹疫苗株病毒提供實驗室證據。

麻疹野病毒；麻疹疫苗株病毒；逆轉錄多聚酶鏈式反應；限制性片段長度多態性分析方法

麻疹是一種具有高度傳染性的急性發熱出疹性疾病，是疫苗可預防的傳染病[1-3]，通過進行含麻疹成分疫苗（Measles-containing Vaccine，MCV）免疫接種，麻疹可以得到很成功的控制[4-6]。因此，麻疹也已被世界衛生組織（WHO）列為繼全球消滅天花和即將消滅脊髓灰質炎之后下一個擬被消除的傳染病。目前，麻疹減毒活疫苗雖已證明是高免疫性、安全有效的疫苗，由于疫苗本身的特性和機體個體差異的原因，大約2%的受種者可出現暫時性皮疹[7]，部分會發生減毒活疫苗引起的疫苗相關麻疹病例（Vaccine-associated Measles Case，VAMC）。在疫苗時代的麻疹野病毒感染臨床表現缺少典型性，多為輕型麻疹，與VAMC不易區分。

對疑似麻疹病例，符合以下5項標準可以診斷為VAMC[8]：⑴病人有出疹癥狀，伴有或不伴有發熱，無咳嗽或其他與出疹相關的呼吸道癥狀；⑵出疹前7～14d曾接種過MCV；⑶接種MCV后8～56d采集血標本，檢測其麻疹免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M陽性；⑷現場調查未發現任何與此病例相關的二代麻疹病例；⑸經現場流行病學調查和實驗室檢測無其他原因可以解釋。

由于麻疹病毒只有一個血清型，依靠血清學檢測無法區分是疫苗株，還是野毒株感染。目前，主要還是依靠基因序列分析的方法，來鑒定麻疹病毒是疫苗株，還是野病毒及其基因型。序列分析對實驗室設備及人員要求較高，且需要時間較長，因此，建立一種簡便快速容易操作的鑒別麻疹疫苗株與野毒株的方法非常必要。

逆轉錄-聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR RFLP）經AflⅡ酶切作用后，因中國麻疹病毒疫苗株基因在7666～7671bp位置有AflⅡ（CTTAAG）酶切位點，而其它所有23種基因型麻疹野病毒在此位置均無此酶切位點，不能被AflⅡ酶切，因此，我們采用本實驗室于2011年引進建立的逆轉錄-聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，RT-PCR RFLP）方法[9]檢測是否含有AflⅡ酶切位點對2015年江西省出疹前7～14d接種過MCV的2例疑似麻疹病例咽拭子標本進行麻疹疫苗株病毒快速鑒別。

在麻疹病毒的基因組中，血凝素（Hemagglutinin，H）蛋白基因和核蛋白（Nucleoprotein，N）基因是變異較大的基因，尤其是N基因羧基(COOH)末端450個核苷酸是麻疹病毒基因組中變異最大的區域。世界衛生組織(WHO)規定這450個核苷酸是鑒定基因型別所需的最少序列，擴增并測定此基因片段，并與WHO推薦的23種基因型參考株的序列做比較，以鑒定基因型[10，11]。因此，我們還對對2015年江西省2例疑似VAMC咽拭子標本N基因羧基末端450個核苷酸進行序列測定分析來驗證鑒別結果。

1 材料與方法

1.1 標本采集對出疹前7～14d接種過MCV的2例疑似麻疹病例根據《全國麻疹監測方案》[12]要求進行血清學和病原學臨床檢測標本采集和運送。血清標本采集時間為接種MCV后8～56d，編號為2015JXMZX032和2015JXMZX035；咽拭子標本編號為2015JXMZY032和2015JXMZY035。

1.2 麻疹IgM抗體和風疹IgM抗體檢測血清標本麻疹IgM抗體和風疹IgM抗體檢測采用捕捉酶聯免疫吸附（ELISA）方法，具體按照麻疹IgM抗體體檢測試劑盒（珠海海泰生物有限公司，Lot No：20150203）和風疹IgM抗體檢測試劑盒（珠海海泰生物有限公司，Lot No：20150304）操作說明書進行。

1.3 病毒RNA提取取咽拭子標本200μl，采用Qiagen公司的Reansy Mini kit（Cat No：74106）提取病毒RNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。1.4 RT-PCR-RFLP方法鑒別VAMC

1.4.1 RT-PCR反應體系和步驟引物擴增的靶序列為包含AflⅡ酶切位點（CTTAAG）的麻疹病毒H基因部分片段，見參考文獻[9]，由上海生工合成，擴增產物大小為438bp。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒（Cat No：210212），進行逆轉錄擴增，反應體系50μl，其中5×Buffer 10μl、10mmol/LdNTP 2μl、Enzyme Mix 2μl、RNA酶抑制劑（40U/μl）0.25μl、上下游引物(50μmol/L)各0.5μl、無RNA酶水29.75μl、RNA模板5μl。反應條件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循環如下：94℃30s，50℃30s，72℃1min，30次循環，72℃10min。

1.4.2 限制性片段長度多態性分析方法[9]酶切反應體系為：PCR產物10μl、AflⅡ酶（Takara公司）1μl和AflⅡ酶自帶緩沖液2μl。每份標本均同時設陰性對照管，僅含原標本PCR反應產物10μl。另外，使用麻疹風疹聯合減毒活疫苗（北京天壇生物制品股份有限公司，Lot No：201501007）作為麻疹疫苗病毒陽性對照。酶切反應體系置于37℃水浴1h。將經37℃水浴1h后的對照管和酶切管中的PCR產物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 麻疹病毒N基因序列測定

1.5.1 麻疹病毒N基因序列擴增及測定引物擴增的靶序列為包含N基因羧基末端450個核苷酸片段，具體序列為，MeV216：5‘-TGGAGCTATGCC ATGGGAGT-3’和MeV2：145‘-TAACAATGATGG AGGGTAGG-3’，由上海生工合成。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒（Cat No 210212）進行RT-PCR反應，相關操作按照試劑盒說明書進行。反應條件：60℃1min，42℃12min，50℃45mim，95℃15min，PCR循環如下：94℃30s，50℃30s，72℃1min，30次循環，72℃10min。擴增出的基因片段送上海生工進行序列測定。

1.5.2 N基因序列分析運用Bioedit 7.0和MEGA 4.0軟件對測定的序列與參比序列做基因序列分析和構建進化樹。用于構建進化樹的各參考株和標準株基因序列均從GenBank下載。

2 結果

2.1 麻疹IgM抗體和風疹IgM抗體檢測2015JXMZX032和2015JXMZX035血清標本麻疹IgM抗體均為陽性，風疹IgM抗體均為陰性。

2.2 RT-PCR-RFLP方法快速鑒別VAMC結果2份咽拭子標本的RT-PCR陽性產物經Afl II酶切后，均被切成兩個片段，呈兩條帶，分別為287bp、151bp，與目的酶切片段大小一致，見圖1。

2.3 N基因序列測定結果運用Bioedit 7.0和MEGA 3.0軟件對2份標本麻疹病毒N基因羧基末端450個核苷酸序列進行分析，并與世界衛生組織（WHO）公布的23種基因型30條參考序列以及中國麻疹疫苗株（滬191株）序列進行比較，構建基因進化樹。結果顯示，此兩份標本與疫苗株代表株滬191株在同一進化小分支，Bootstrap值：100，一般認為進化樹Bootstrap值大于70%具有統計學意義[13]；核苷酸同源性均為100%，提示這2份標本為麻疹疫苗株病毒A基因型，詳見圖2。序列測定結果與RT-PCR-RFLP方法的鑒定結果一致，2015JXMZY032和2015JXMZY035為麻疹疫苗株病毒。

圖2 N基因羧基末端450個核苷酸系統進化樹

3 討論

2013年，國務院《衛生事業發展“十二五”規劃》提出了要努力實現消除麻疹的目標[14]。加強適齡兒童含麻疹成分疫苗（Measles-containing Vaccine，MCV）高水平的接種率，是實現消除麻疹目標的首要措施。目前江西省兒童免疫首劑接種使用麻疹風疹聯合減毒活疫苗(Measles and rubella combinedattenuated live vaccine，MR)，復種使用麻疹流行性腮腺炎風疹聯合減毒活疫苗。隨著麻疹減毒活疫苗的廣泛使用，麻疹野病毒引起的病例會越來越少，而由疫苗株引起的麻疹樣病例會越來越多，隨著麻疹消除工作的進程，減毒活疫苗引起的疫苗相關麻疹病例會更加的凸顯。

麻疹病毒、風疹病毒均可引起人群以發熱、出疹為主要表現的急性呼吸道傳染病，二者在臨床癥狀上難以區分，有時甚至會出現兩種病毒混合流行的暴發疫情[15-17]，因此，本研究對這2例疑似麻疹病例接種MCV后8～56d采集血標本血清標本同時進行麻疹IgM抗體和風疹IgM抗體檢測，結果為麻疹IgM抗體陽性，風疹IgM抗體陰性，排除風疹病毒感染，為疑似麻疹病例。由于該2例疑似麻疹病例在出疹前7～14d接種過MCV，麻疹IgM抗體陽性，現場流行病學調查也未發現與此病例相關的二代麻疹病例，根據VAMC診斷標準，可以初步判斷為VAMC。

本研究通過運用RT-PCR-RFLP方法快速鑒別了該2例疑似麻疹病例為麻疹疫苗相關麻疹病例，首次對我省麻疹疫苗株病毒的證實提供實驗室證據。另外，本研究還對該2例病例咽拭子標本進行N基因羧基末端450個核苷酸序列測定和分析，在基因層面進一步證實。兩種實驗方法檢測結果一致。

因此，科學、正確、及時地鑒別麻疹疫苗株病毒，為判定是否達到消除麻疹指標提供技術支撐，為我省麻疹預防與控制工作提供科學依據，對努力實現消除麻疹目標是非常重要的。

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Rapid identification of measles vaccine strain virus in Jiangxi Province in 2015

GONG Tian，ZHANG Yanni，SHI Yong，LI Jianxiong，ZHOU Jun.Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention，Nanchang 330029，China.

Objective Using reverse transcription polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism analysis method to identify rapidly the Measles vaccine strain virus in Jiangxi Province，in 2015.Methods We identifyed two cases of suspected vaccine associated measles throat swab specimens by detecting whether they contains Afl II enzyme cutting site with RTPCR-RFLP method.At the same time，the carboxyl terminal 450 nucleotides of N gene was sequenced and analyzed，confirming the result obtained by RT-PCR-RFLP method.Results The identification results of RT-PCR-RFLP method is that two throat swab specimens can be Afl II enzyme incision，and the N gene sequence determination results for measles vaccine strain virus of genotype A.Conclusion Our study provides laboratory evidence for measles vaccine strain in Jiangxi Province for the first time.

Measles wild virus；Measles vaccine strain virus；Reverse transcription-polymerase chain reaction；Restriction fragment length polymorphism

R511.1，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0174-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.011

2016-08-17；

2017-03-09)

龔甜，女，1982年生，碩士，副主任技師，主要從事麻疹和風疹等病毒的實驗室監測工作。