宜春市2015年麻疹病毒野病毒感染病例的快速鑒別

張紅波，莫尚鵬，陳玉紅，羅維，熊英，龔甜，徐燁

(1、宜春市疾病預防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民醫院，江西宜春336000)

宜春市2015年麻疹病毒野病毒感染病例的快速鑒別

張紅波1，莫尚鵬1，陳玉紅1，羅維1，熊英2，龔甜2，徐燁3

(1、宜春市疾病預防控制中心，江西宜春336000；2、江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029；3、宜春市人民醫院，江西宜春336000)

目的引進并運用逆轉錄多聚酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析方法（RT-PCR-RFLP方法）快速鑒別2015年宜春市麻疹野病毒感染病例與疫苗株病毒引起的相關麻疹病例。方法運用realtime RT-PCR對宜春市400例疑似麻疹病例咽拭子標本進行麻疹病毒核酸檢測，引進RT-PCR-RFLP方法對麻疹病毒核酸檢測陽性咽拭子標本進行檢測是否含有AflⅡ酶切位點（疫苗株病毒有，野病毒沒有）鑒別疫苗相關麻疹病例。結果麻疹病毒核酸檢測陽性標本為9例，陽性率為2. 25%；9例麻疹病毒核酸檢測陽性標本RT-PCR-RFLP方法檢測的結果為均未能被AflⅡ酶切開，為麻疹野病毒感染。結論成功引進和建立宜春市麻疹野病毒感染病例與疫苗株病毒引起的相關麻疹病例的RT-PCR-RFLP快速鑒別方法，并鑒別了2015年宜春市9例麻疹病例均由麻疹病毒野病毒感染引起。

麻疹野病毒；麻疹疫苗株病毒；逆轉錄多聚酶鏈式反應；限制性片段長度多態性分析方法

麻疹是一種傳染性很強的呼吸道傳染病，嚴重危害兒童健康，隨著麻疹減毒活疫苗(Measles At-tinuated Live Vaccine，MV)的廣泛使用，麻疹的發病得到了有效的控制[1，2]。在廣泛使用麻疹減毒活疫苗（Measles Attenuated Live Vaccine）后，麻疹在世界大多數地區得到了成功的控制；因此，麻疹也已被世界衛生組織（WHO）列為繼全球消滅天花和即將消滅脊髓灰質炎之后下一個擬被消除的傳染病。加強適齡兒童含麻疹成分疫苗（Measlescontaining Vaccine，MCV）高水平的接種率，是實現消除麻疹目標的首要措施。接種MCV后，由于疫苗本身的特性和機體個體差異的原因，會出現疫苗接種后反應，如發熱、皮疹；甚至出現減毒活疫苗引起的疫苗相關麻疹病例（Vaccine associated Measles Case，VAMC）這些少數個體因接種MV出現的麻疹樣臨床反應，這與麻疹野病毒引起的不典型麻疹病例在臨床上難以區分。為了提高本市麻疹實驗室診斷水平，及時對本市VAMC進行鑒別，本實驗室引進本省省級麻疹實驗室建立逆轉錄多聚酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析方法（RT-PCR-RFLP方法）[3]對本市2015年麻疹實驗室的監測工作發現的麻疹樣病例是否由麻疹野病毒感染引起的病例或由接種疫苗引起的疫苗相關麻疹病例進行快速鑒別，現將研究具體情況進行分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集根據2013年版的《全國麻疹監測方案》[4]要求采集麻疹暴發和（或）散發疫情麻疹疑似病例咽拭子標本，咽拭子標本保存在3ml麻疹病毒標本運輸液(含5%牛血清、終濃度2000U/ml青霉素、200μg/ml鏈霉素和25U/ml制霉菌素的細胞培養液)中，冷藏運送。

1.2 麻疹病毒核酸檢測

1.2.1 病毒RNA提取取病毒培養物200μl，采用Qiagen公司的Reansy Mini kit（Cat No：74106）提取病毒RNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2 realtime RT-PCR檢測采用ABI公司生產的AgPath-ID(TM)One-step RT-PCR Kit（Cat No：1005）進行反應體系配制，總體積為25μl，相關操作按照試劑盒說明書進行。反應條件：46℃10min，95℃預變性10min，95℃變性15s，60℃延伸45s，（收集熒光信號），共45個循環。反應在美國ABI熒光PCR儀7300進行。麻疹病毒引物和探針參照文獻[5]，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，具體序列如表1。

表1 麻疹病毒Realtime RT-PCR引物和探針堿基序列

1.3 RT-PCR-RFLP方法鑒別VAMC

1.3.1 RT-PCR反應體系和步驟引物為包含AflⅡ酶切位點（CTTAAG)的麻疹病毒H基因部分片段，上游引物：5'CTCAATCGAGCATCAGGTCA3'，下游引物：5'TACATTCCCTGGGACGTCAT3'。由上海生工合成，擴增產物大小為438bp。

采用QIAGEN One Step RT-PCR Kit試劑盒（Cat No：210212），進行逆轉錄擴增，反應體系50μl，其中5×Buffer 10μl、10mmol/L dNTP 2μl、Enzyme Mix 2μl、RNA酶抑制劑（40U/μl)0.25μl、上下游引物（50μmol/L)各0.5μl、無RNA酶水29.75μl、RNA模板5μl。反應條件：60℃1min，42℃10min，50℃30mim，95℃15min，PCR循環如下：94℃30s，50℃30s，72℃1mins，30次循環，72℃10min。

1.3.2 限制性片段長度多態性分析方法[3]取Realtime RT-PCR檢測麻疹病毒核酸陽性標本RTPCR產物10μl、1μl AflⅡ酶（Takara公司Cat No：1236A）和2μl Buffer于EP管中，并設對照管：10μl PCR產物；陽性對照為麻疹風疹聯合減毒活疫苗（北京天壇生物生物制品股份有限公司，Lot No：201501007）置于37℃水浴1h。將經37℃水浴1h后的對照管和酶切管中的PCR產物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 麻疹病毒核酸檢測結果和病例特征分析

2.1.1 麻疹病毒核酸檢測結果2015年共檢測麻疹疑似病例咽拭子標本400例，其中麻疹病毒核酸陽性標本9例，陽性率為2.25%。

2.1.2 病例特征分析時間分布主要集中在5月、6月份、8月份和11月份。人群分布：男性6例、女性3例；年齡主要分布在小年齡組8月齡～2歲齡組（7例），最小發病年齡為8月齡，最大為23歲。麻疹疫苗免疫史：無含麻疹成分疫苗（MCV）免疫史5例，免疫史不詳1例，免疫史不詳的比例與年齡沒有明顯相關性。

2.2 RFLP方法鑒別麻疹病毒疫苗株與野毒株結果9例麻疹病毒核酸陽性標本PCR產物和對照管均為被AflⅡ酶切開，呈單一條帶，分子量438bp（見圖1、圖2），提示此9例毒株均為麻疹病毒野毒株。疫苗代表株（Shanghai-191株）被AflⅡ酶切開為2個片段（分別為287bp、151bp）。

圖1 RFLP方法鑒別麻疹病毒疫苗株與野毒株結果

3 討論

麻疹是兒童最常見的急性呼吸道傳染病之一，其傳染性很強，在人口密集而未普種疫苗的地區易發生流行，2～3年一次大流行。麻疹病毒通過呼吸道分泌物飛沫傳播。臨床上以發熱、上呼吸道炎癥、眼結膜炎及皮膚出現紅色斑丘疹和頰黏膜上有麻疹黏膜斑，疹退后遺留色素沉著伴糠麩樣脫屑為特征。常并發呼吸道疾病如中耳炎、喉-氣管炎、肺炎等，麻疹腦炎、亞急性硬化性全腦炎等嚴重并發癥。目前尚無特效藥物治療。

圖2 RFLP方法鑒別麻疹病毒疫苗株與野毒株結果

我國自1965年，開始普種麻疹減毒活疫苗后發病顯著下降。目前宜春市兒童免疫首劑接種使用麻疹風疹聯合減毒活疫苗(Measles and rubella combinedattenuated live vaccine，MR)，復種使用麻疹流行性腮腺炎風疹聯合減毒活疫苗。麻疹減毒活疫苗雖已證明是高免疫性、安全有效的疫苗，由于疫苗本身的特性和機體個體差異的原因，大約2%的受種者可出現暫時性皮疹[6]，部分會發生減毒活疫苗引起的疫苗相關麻疹病例（Vaccine associated Measles Case，VAMC）。麻疹減毒活疫苗的廣泛使用后，麻疹野病毒引起的病例會越來越少，2015年宜春市麻疹病毒核酸檢測陽性率僅為2.25%，陽性率較低，可能是因為在疫苗時代的麻疹野病毒感染臨床表現缺少典型性，根據《全國麻疹監測方案》[4]采集的疑似麻疹病例可能有部分是由其它病原引起的發熱出疹性疾病，在臨床癥狀上不易鑒別。隨著麻疹減毒活疫苗使用與麻疹消除工作的進程，疫苗株引起的麻疹樣病例也會逐漸增多。2013年，國務院《衛生事業發展“十二五”規劃》提出了要努力實現消除麻疹的目標[7]，科學、正確、及時地鑒別麻疹疫苗株病毒，對努力實現消除麻疹目標是非常重要的。

本研究成功引進江西省省級麻疹實驗室建立的疫苗相關麻疹病例RT-PCR-RFLP快速鑒別方法，并且對2015年江西省宜春市9例疑似麻疹病例咽拭子標本進行鑒定，鑒定的結果為麻疹野毒株引起的麻疹病例。

通過引進疫苗相關麻疹病例RT-PCR-RFLP快速鑒別技術，提高了本市麻疹實驗室診斷鑒定水平，并加強了我市麻疹樣病例實驗室的監測工作的能力。運用疫苗相關麻疹病例RT-PCRRFLP快速鑒別技術可以更加及時地指導我市麻疹防控工作，及時區分麻疹野病毒感染病例和麻疹疫苗株病毒引起的相關病例，為我市麻疹預防與控制工作提供科學依據。

【致謝】感謝江西省疾病預防控制中心疾病控制檢驗所對本研究的大力支持。

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Rapid identification of nine wild measles virus strains in 2015，Yichun City

ZHANG Hongbo，MO Shangpen，CHEN Yuhong，et al.Center for Disease Control and Prevention，Yichun Jiangxi，336000，China.

Objective To establish and apply reverse transcription polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis(RT-PCR-RFLP method)for rapidly identifying wild measles virus strains and vaccine strains in Yichun City in 2015.Methods The RT-PCR assay was used to detect cases of suspected measles cases throat swab specimens for the virus nucleic acid detection.RT-PCR-RFLP was adopted to identify wild strains and vaccine strains by determining the existence of enzyme-containing AflⅡrestriction site(vaccine strains，not wild strain).Results Nine cases of positive measles virus specimens were detected，accouting for 2.25%.RT-PCR-RFLP identification result was as follows：The strain showed a single band，which means it can not be digested by AflⅡ.Conclusion A method for rapid identification of Yichun City of wild measles virus strains and vaccine strains was introduced，and identified nine cases of Yichun City in 2015 suspected measles cases caused by wild measles virus infection.

Measles wild virus；Measles vaccine strain virus；Reverse transcription-polymerase chain reaction；Restriction fragment length polymorphism

R511.1，R446.62

A

1674-1129(2017)02-0199-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.019

2016-07-22；

2017-03-10)

張紅波，男，1984年生，學士學位，主管技師，主要從事微生物及病毒的實驗室監測工作

莫尚鵬，男，1977年生，學士學位，主管技師，主要從事微生物及病毒的實驗室監測工作。E-mail：233270758@qq.com