E—鈣粘蛋白、可溶性E—鈣粘蛋白在胃部疾病中的檢測及其意義

陳亞輝

摘要：目的 研究E-鈣粘蛋白（E-cad）、可溶性E-鈣粘蛋白（sE-cad）的檢測在早期診斷幾種胃部疾病，包括慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍、胃黏膜腸上皮化生、胃癌的臨床意義。方法 139例因出現胃腸道癥狀而接受胃鏡檢查并配合活檢確診為慢性萎縮性胃炎38例，胃潰瘍33例，胃黏膜腸上皮化生28例，胃癌22例，18例無任何病例改變者作為正常對照組。采用免疫組化及雙抗夾心酶聯免疫吸附法分別檢測各標本組織中E-cad的表達情況及胃液中sE-cad水平。結果 慢性萎縮性胃炎組、胃黏膜腸上皮化生組、胃癌組E-cad的表達均較對照組有下降，其差異有統計學意義（P<0.01）；慢性萎縮性胃炎組、胃黏膜腸上皮化生組、胃癌組血清中sE-cad的水平較對照組升高，其差異有統計學意義（P<0.01）。結論 胃黏膜組織中E-鈣粘蛋白的表達情況及血清中可溶性E-鈣粘蛋白的水平檢測可作為胃癌及癌前病變的有力依據。

關鍵詞：E-鈣粘蛋白；可溶性E-鈣粘蛋白；胃炎；胃黏膜腸上皮化生；胃潰瘍；胃癌

E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）作為細胞粘附分子成員之一，其表達的上調或下調對炎癥的發生，腫瘤的的侵襲、轉移有密切關系[1-2]。國內外研究發現，胃癌組織中E-cad的表達較正常胃黏膜組織明顯減少或缺失，且呈異質性或非極性變化[3-4]。本文選取確診為胃癌及癌前病變的幾種胃部疾病患者，檢測其胃黏膜組織中E-cad的表達及血清中sE-cad的水平。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年1月～2015年12月我院門診、普外科、消化內科因胃部疾病而接受采血及胃鏡檢查明確診斷的139例患者，其中男性74例，女性65例。

1.2方法

1.2.1標本采集 所有對象于胃鏡前1d晨空腹采集，所采集靜脈血靜置1 h，2500 rpm，離心10 min，獲取血清，放置低溫冰箱，-80℃保存待測。

1.2.2免疫組織化學檢測 一抗為兔抗人E-cad抗體，標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm，經脫蠟水化后微波抗原修復。免疫組化采用S-P法，E-cad單克隆抗體及S-P試劑盒均為Santa Cruz公司生產，按照說明書操作。操作步驟：①石蠟切片的脫蠟水化：切片置于烤箱中65℃融蠟2 h后，于二甲苯中脫蠟二次（5 min/次），再依次浸入濃度梯度乙醇中（依次為無水乙醇-無水乙醇-95%-85%-75%乙醇），最后置于蒸餾水中各水化5 min。②石蠟切片的抗原修復：石蠟組織切片用檸檬酸緩沖液高壓修復。其中修復工作液配制：在1 L去離子水中加入10 ml檸檬酸緩沖液（即IHC抗原修復液，100×），均勻混合即可。具體修復步驟：將修復液置于高壓鍋中，并將待修復切片浸泡于修復液里（液體必需蓋過組織），蓋上高壓鍋蓋，加熱直至高壓鍋噴汽，立即開始計時，1～2 min后將高壓鍋撤離熱源，自然降溫，取出切片，用蒸餾水（0.01 M，pH值7.4）漂洗2～3次，持續3 min/次。③滴加適量試劑1（即內源性過氧化物酶封閉液），室溫下孵育10 min后，用PBS充分洗滌。④滴加適量試劑2（封閉用正常羊血清工作液），室溫下孵育10 min后，輕輕甩干。⑤滴加適量一抗工作液（按適當比例稀釋的濃縮抗體即1∶200兔抗大鼠E-cad抗體）后，置于濕盒中，并于4℃冰箱中孵育過夜，第2d晨用PBS充分淋洗，輕輕甩干。⑥滴加適量試3（生物素標記山羊抗兔二抗工作液），室溫孵育30 min后，用PBS充分淋洗。⑦滴入適度的試劑4（HRP 標記的鏈霉親和素），室溫下孵育10 min后，用PBS洗滌充分。⑧DAB顯色劑的制備：按實驗所需量，將試劑B與試劑A以19∶1的體積比混勻后即可。也可選擇每毫升試劑B中滴加1滴（約50 μl）試劑A，混勻后即可。⑨顯色劑顯色：加適量的上述顯色液滴于需要顯色的組織切片上，立即顯色，控制時間在1～5 min。通過顯微鏡下觀察控制顯色時間，當達到最佳顯色效果后，立即自來水沖洗終止顯色。顯色后的切片經復染、脫水透明，封片后，于電子顯微鏡下觀察結果并拍片。取正常胃粘膜作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。正常胃黏膜E-cad在粘膜上皮細胞膜著色呈棕黃色。根據著色細胞數目和著色強弱來判斷結果。觀察每張病理切片對角線的8個視野，根據文獻[5]將染色計為0～3分。0分：細胞膜、細胞質均未染色；1分：細胞質染色為主；2分：異質性染色（細胞膜、胞質混合染色）；3分：連續的細胞膜染色。

1.2.3 ELISA法檢測 將-80℃保存的標本置于室溫溶解，各待測標本的sE-cad濃度檢測操作步驟嚴格按sE-cad ELISA試劑盒說明書進行。

1.3統計學處理 各樣本計數資料采用SPSS17.0軟件包統計處理，組間計數資料差異比較采用卡方檢驗。

2 結果

2.1 E-cad在正常黏膜組織、慢性萎縮性胃炎組織、胃潰瘍組織、胃黏膜腸上皮化生組織的表達情況 正常胃黏膜上皮幾乎全部上皮細胞膜著色，在細胞相鄰的側面呈連續、同質和極性分布。慢性萎縮性胃炎組織、胃黏膜腸上皮化生組織、胃癌組織中E-cad呈異常表達，細胞膜不著色，或者著色淡、或異質性著色（點狀、間斷狀、小團塊胞漿著色），且明顯喪失極性（各方向均可見著色）。各實驗組與正常組間有顯著性差異（P<0.05），慢性萎縮性胃炎組、胃黏膜腸上皮化生組與胃癌組的表達情況有顯著差異（P<0.05），其表達量陽性率高低順序是，胃潰瘍組>慢性萎縮性胃炎組>胃黏膜腸上皮化生組>胃癌組。

2.2不同組別血清中sE-cad的含量明顯高于正常對照組，并具有統計學意義（P<0.01或P<0.05），見表1。

3 討論

E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad）是一個相對分子量為120 kd的鈣依賴性細胞粘附分子，定位于細胞間彼此連接的細胞膜處，跨越細胞膜全層，能夠介導粘附連接蛋白連接相鄰細胞并使細胞-細胞間的連接成熟[6]。血清可溶性E-cad（sE-cad）是位于16號染色體長臂22.1區帶基因編碼的一種跨膜糖蛋白，分子量約為80～84 KD，是E-cad細胞外蛋白的水解片段。既往國內外眾多研究證實，上皮細胞內E-cad的表達下調能導致細胞連接松散，破壞成熟組織結構的完整性和極性[7]。

本研究測得結果，胃黏膜組織中E-cad的表達量為：胃潰瘍組>慢性萎縮性胃炎組>胃黏膜腸上皮化生組>胃癌組；而血清中sE-cad的水平結果是：胃癌組>胃黏膜腸上皮化生組>慢性萎縮性胃炎組>胃潰瘍組。上述結果表明，E-cad的表達降低與胃癌及其癌前病變的發生有密切的關系。而這一結果也符合從正常胃黏膜發展到胃癌所經過慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生的過程。

綜上所述，E-cad作為一種新的腫瘤標志物，其在胃黏膜病變組織中的表達情況結合血清中可溶性E-cad的濃度可作為胃癌及癌前病變判斷的重要指標，為胃癌的早期發現提供有力的依據。

參考文獻：

[1]Bajpai S，Correia J，Feng Y，et al.{alpha-Catenin mediates initial E-cadherin-dependent cell-cell recognition and subsequent bond strengthening[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（47）：18331-18336.

[2]Tsang J Y，Mendoza P，Putti T C，et al.E-cadherin expression in the epithelial components of mammary phyllodes tumors[J].Human Pathology，2012，43（12）：2117.

[3]李東印，馬玉泉，李克.胃癌中E-鈣粘蛋白的表達意義[J].世界華人消化雜志，2001，9（8）：974-975.

[4]Henke R T，Maitra A，Paik S，et al.Gene expression analysis in sections and tissue microarrays of archival tissues by mRNA in situ hybridization[J].Histology&Histopathology，2005，20（1）：225.

[5]周岱翰.臨床中醫腫瘤學[M].北京：人民衛生出版社，2003：575.

[6]David J M，Rajasekaran A K.Dishonorable Discharge：The Oncogenic Roles of Cleaved E-cadherin Fragments[J].Cancer Research，2012，72（12）：2917-2923.

[7]Wheelock M J，Johnson K R.Cadherins as modulators of cellular phenotype[J].Annual Review of Cell&Developmental Biology，2003，19（1）：207.

編輯/楊倩