神經生長因子促進大鼠脛骨骨折愈合的實驗研究

劉建軍，韓慶斌，李新志，黃亮，王茂鵬

（1.三峽大學仁和醫院骨科；2.三峽大學仁和醫院腎內科，湖北 宜昌 443001）

神經生長因子促進大鼠脛骨骨折愈合的實驗研究

劉建軍1，韓慶斌1，李新志1，黃亮2，王茂鵬1

（1.三峽大學仁和醫院骨科；2.三峽大學仁和醫院腎內科，湖北 宜昌 443001）

目的 觀察神經生長因子對大鼠脛骨骨折愈合以及胰島素樣生長因子表達的影響。方法建立標準大鼠脛骨骨折模型,分別給予生理鹽水和神經生長因子，術后1、2、4周分別進行X線骨痂評定、脛骨濕重稱量以及半定量RT-PCR檢測胰島素樣生長因子-1 mRNA的表達。結果術后4周時，神經生長因子組骨痂量（132.63±5.98）mm3和脛骨濕重（0.98±0.12）g，對照組骨痂量（85.22±6.23）mm3和脛骨濕重（0.84±0.04）g，NGF組顯著多于對照組(P＜0.05)；神經生長因子組的胰島素樣生長因子-1 mRNA的表達術后1周時為（0.82±0.17），術后2周時為（0.54±0.08），對照組分別為（0.55±0.20）、（0.41±0.09）。NGF組顯著高于對照組(P＜0.05)。結論應用神經生長因子可以促進大鼠脛骨各組愈合，同時促進骨折愈合過程中IGF-1表達。

神經生長因子；骨折愈合；胰島素樣生長因子-1；大鼠；脛骨骨折模型

神經因素在骨折愈合過程中發揮著重要作用，眾多神經因子，特別是神經生長因子(NGF)，對骨折愈合的促進作用日益得到證實[1-2]。然而，神經生長因子促進骨折愈合的作用機制尚不完全清楚，有研究表明，神經生長因子與其它細胞因子之間存在協同作用，但神經生長因子與胰島素樣生長因子-1(IGF-1)之間的聯系尚不明確。胰島素樣生長因子-1是對成骨細胞具有促進增殖和分化作用的一種生長因子，既可以作用在局部又可作用在全身[3]。本次實驗旨在通過建立中樞神經損傷合并大鼠脛骨骨折的模型，研究神經生長因子治療骨折時，對胰島素樣生長因子-1的表達的影響，以期望進一步探討神經生長因子促進骨折愈合的機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及試劑 健康雄性SD大鼠60只,體質量(260±20)g，由三峽大學實驗動物中心提供。注射用神經生長因子由廈門北大之路生物工程有限公司提供；總RNA分離試劑、RT-PCR試劑盒分別購自天根生化科技(北京)有限公司、大連寶生物工程有限公司。引物由上海生物工程公司合成，IGF-1上游為5＇-CTT TGC GGG GCT GAG CT-3＇下游引物為5＇-CTT CAG CGG AGC ACA GT-3＇，

擴增產物片段長度為184bp；內參照3＇-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）上游引物5＇-CAC CCT GTT GCT GTA GCC ATA TTC＇，下游引物5＇-GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG-3′，擴增片斷196bp。

1.2 實驗方法

1.2.1 脛骨骨折模型制作 大鼠經體積分數為5%的水合氯醛腹腔內注射麻醉后，對右后肢脫毛、消毒，于小腿中上1/3行前正中切口長約1.5 cm,切開皮膚皮下及筋膜,扒開脛前肌,在脛骨結節下1.0 cm處橫形切斷脛骨，以1.0 mm克氏針經遠端髓腔穿出，復位后逆行打入骨折近端。生理鹽水沖洗，逐層關閉切口。

1.2.2 實驗分組及給藥方法 將實驗動物隨機分為兩組，每組給藥如下：第1組為給予等劑量的生理鹽水的正常對照組；第2組為給予神經生長因子治療組，神經生長因子肌注200 ng/kg，1次/d。分別注射兩側腓腸肌，給藥1 w、2 w、4 w后,每次隨機從各組中選取10只大鼠進行各項指標的測定。

1.2.3 骨痂評定 術后1 w、2 w、4 w麻醉狀態下行脛骨X線攝片檢查，測量采用DR閱片的PACS系統，攝片和測量由兩位醫生按照雙盲原則進行測定。骨痂體積測量采用Perkins法，即V=2πr1(r2-r1)L，其中，r1為骨半徑，r2為骨痂半徑，L為骨痂長度。

1.2.4 脛骨全長標本濕重 術后1 w、2 w、4 w各組取大鼠，麻醉狀態下處死動物，取脛骨全長，采集時均注意保護骨折附近區域組織以免破壞骨痂組織，去除內固定物，用天平稱脛骨全長標本濕重。

1.2.5 應用反轉錄聚合酶聯反應(RT-PCR)法檢測胰島素樣生長因子-1(IGF-1)mRNA的表達 于骨折處上、下各2 mm處截取骨痂標本，液氮凍存。標本研磨勻漿后，以Trizol試劑一步法提取細胞總RNA，隨后進行反轉錄和PCR，分別以各自的引物擴增GAPDH、IGF-1。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃ 45s、54℃ 45s、72℃ 45s；72℃延伸6 min，進行29個循環，以GAPDH為內參照，DNA條帶的單位面積光密度(OD)用凝膠成像儀測定,以待測基因與相應內參照光密度比值作為mRNA的相對表達量。圖像分析采用真彩色醫學圖像分析軟件(Image-proplus 6.0)對結果進行半定量分析。

1.3 統計學方法 數據用SPSS 10.0統計軟件進行分析，計量資料采用“±s”表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

實驗動物選用大鼠60只，無脫失，全部進入結果分析。

2.1 X線骨痂體積測量 術后1 w時兩組比較差異無統計學意義；術后2 w時，NGF組骨痂量多于對照組，但差異無統計學意義；術后4 w時，NGF組骨痂量顯著多于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 術后兩組大鼠骨痂體積測量結果(mm3)Table 1 Comparison of bony callus volume between two groups(mm3)

2.2 脛骨濕重稱量 術后1 w和2 w兩組比較差異無統計學意義；術后4 w時，NGF組骨脛骨濕重顯著高于對照組（P＜0.05）。見表2。

2.3 胰島素樣生長因子-1(IGF-1)mRNA表達的測定 術后1 w和2 w時，NGF組IGF-1 mRNA表達量顯著高于對照組(P＜0.05)，尤其以術后第1周時更明顯(P＜0.01)；術后4 w時，兩組表達量比較差異無統計學意義。見表3、圖1。

表2 術后兩組大鼠脛骨濕重測量結果(g)Table 2 Comparison of tibia wet weighing between two groups(g)

表3 術后兩組大鼠IGF-1 mRNA表達(IGF-1/GAPDH)Table 3 Comparison of the expression of IGF-1 mRNAbetween two groups(IGF-1/GAPDH)

圖1 術后胰島素樣生長因子1(IGF-1)mRNA PCR電泳圖Figure 1 The electrophoregram of IGF-1 mRNA注：M為Marker，1、3、5分別為術后1w、2w、4w時IGF-1 mRNA；2、4、6分別為術后1w、2w、4w時GAPDH mRNA

3 討論

隨著高能量和開放性損傷病例的增多，以及不當的手術治療，骨折不愈合的病例在臨床上屢見不鮮。盡管眾多新觀念、新技術廣泛應用于臨床實踐，但骨折不愈合的治療目前仍然面臨著許多難題。骨折愈合是一個復雜的骨再生過程，除適當的生物力學環境等因素外，多種組織細胞及各種細胞因子之間的相互作用在骨折的愈合中也發揮了重要的作用。

學界很早就注意到合并中樞神經損傷的骨折愈合明顯加速，骨痂生成明顯增多[4]。Bidner的研究認為中樞神經損傷后，某些生長因子能夠透過血腦屏障釋放出來，作用于骨折局部發揮作用[5]。因而，以神經生長因子為代表的神經因子在骨折愈合中的作用得到了廣泛關注。神經生長因子是最初發現能夠促進神經細胞生長的一種生長發育的因子，并作為治療神經系統疾病的藥物，已經廣泛應用于臨床。隨著研究的深入，神經生長因子促進骨折愈合的作用也日益證實[6-7]。有學者發現在骨折斷端局部注射治療NGF后，骨痂生成量明顯增多，骨痂剛度和抗折彎強度也顯著增加[8]。國內學者的研究也證實神經生長因子對骨折的修復起著促進作用[9]。神經生長因子通過誘導神經纖維長入，神經生長因子誘導交感和感覺神經纖維長入骨痂的同時,還能刺激P物質、降鈣素基因相關肽等神經肽類物質的釋放，而這些肽類物質能通過抑制骨吸收，促進骨折的成骨[10]。神經生長因子能促進血管內皮細胞分化,加速毛細血管的形成,改善骨折處的血液供應。而其中，刺激骨細胞增殖分化，刺激成骨細胞活性，是神經生長因子促進骨折愈合的一條重要途徑[9]。胰島素樣生長因子-1是骨細胞中含量豐富的生長因子，對成骨細胞功能起到重要的調節作用。胰島素樣生長因子-1在合并腦外傷的骨折患者血清中的水平明顯升高。胰島素樣生長因子-1可促使成骨細胞和骨髓基質細胞增殖和分化，減少骨膠原退化，增加骨質沉積，此外還能促進骨基質合成鈣化，加速骨折愈合。

本實驗也觀察到，神經生長因子促進骨折愈合的同時，也明顯促進了胰島素樣生長因子的分泌。胰島素樣生長因子是骨細胞增值分化的重要刺激因子，因而，神經生長因子可能通過刺激胰島素樣生長因子的分泌，來刺激骨細胞的增殖分化，這可能是神經生長因子促進骨折愈合的重要途徑之一。學界越來越認識到，活性細胞因子在骨折愈合中發揮的重要作用，深入探究骨折愈合中各種生長因子的作用及機理，進一步闡明骨折不愈合和延遲愈合的產生機制，必將為骨折的治療，特別是骨折不愈合的治療起到積極作用。

[1]Zhuang YF,Li J.Serum EGF and NGF levels of patients with brain injury and limb fracture[J]. Asian Pac J Trop Med，2013,6(5):383-386.

[2]懷文娟，韓曉峰，朱穎華.經皮局部注射神經生長因子對骨折愈合的影響[J].中國藥業，2015,34(12):41-42.

[3]Fowlkes JL,Nyman JS,Bunn RC,et al.Osteo-promoting effects of insulin-like growth factor I(IGF-I) in a mouse model of type 1 diabetes[J].Bone,2013,57 (1):36-40.

[4]Brady RD,Grills BL,Church JE,et al.Closed head experimental traumatic brain injury increases size and bone volume of callus in mice with concomitant tibial fracture[J].Sci Rep.2016,29(6):34491.

[5]Kesemenli CC, Necmio?lu S.The role of melatonin as a link between head injury and enhanced osteogenesis[J].Med Hypotheses,2005，65(3):605-606.

[6]鄭少濤,林喜容,周少鵬.腦外傷合并骨折患者血清胰島素生長因子Ⅱ水平的變化[J].中國現代醫生，2014,52(2):19-23.

[7]Chen WH,Mao CQ,Zhuo LL,et al.Beta-nerve growth factor promotes neurogenesis and angiogenesis during the repair of bonedefects[J].Neural Regen Res. 2015,10(7):1159-1165.

[8]Cao J,Wang L,Lei DL,et al.Local injection of nerve growth factor via a hydrogel enhances bone formation during mandibular distraction osteogenesis[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol,2012,113 (1):48-53.

[9]劉振剛,劉宇鵬,李放,等.神經生長因子在骨折愈合中的作用[J].中國醫藥指南,2013,11(4):491-493.

[10]Grills BL,Schuijers JA.Immunohistochemical localization of nervegrowth factor in fractured and unfractured ratbone[J].ActaOrthopScand,1998,69(4):415-419.

Nerve growth factor promotes the bone healing on tibial fracture model of rats

Liu Jian-jun1,Han Qin-bin1,Li Xin-zhi1,Huang Liang2,Wang Mao-peng1
(1.Department of Orthopaedic,Renhe Hospital,Three Gorges University;2.Department of Nephrology,Renhe Hospital,Three Gorges University,Yichang,Hubei,443001,China)

ObjectiveTo study the effect of nerve growth factor(NGF)on tibial fracture healing in rats，and the expression of insulin-like grouth factor-1(IGF-1).Methods60 SD rats were randomly divided into the control group and NGF group.All rats were established tibial fracture models,and were treated by normal saline(NS)or NGF respectively.Then the bony callus volume were evaluated by X-ray at 1,2 and 4 weeks after operation,and tibia wet weighing were weighed.The expression of IGF-1 mRNA were assayed with semiquantitative RT-PCR too.ResultsIn NGF group，bony callus volume is(132.63±5.98)mm3and tibia wet weighing is(0.98±0.12)g.In control group,bony callus volume is(85.22±6.23)mm3and tibia wet weighing is(0.84±0.04)g.NGF group were increased significantly at 4 weeks after operation,compared with the control group(P＜0.05).The expression of IGF-1 mRNA in NGF group,which is(0.82±0.17)at 1 week,(0.54±0.08)at 2 weeks,were increased significantly at 1,2 weeks after operation(P＜0.05),compared with the control group,which is(0.55±0.20)at 1 week,(0.41±0.09)at 2 weeks.Conclusion The results suggest that NGF can stimulated bone healing,and promoted the expression of IGF-1 in the fracture healing process.

Nerve growth factor;Fracture healing;Insulin-like grouth factor-1;Rat;Tibial fracture model

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.11.001

三峽大學2012年青年基金（KJ2012A020）