加味丹參飲含藥血清預處理對缺氧/復氧H9C2心肌細胞自噬相關基因Atg5和Beclin1 mRNA表達的影響

饒春梅 成細華 任 婷 孫彥波 彭 霞 黃政德

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

·基礎研究·

加味丹參飲含藥血清預處理對缺氧/復氧H9C2心肌細胞自噬相關基因Atg5和Beclin1 mRNA表達的影響

饒春梅 成細華 任 婷 孫彥波 彭 霞 黃政德

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

目的 探討加味丹參飲含藥血清預處理對缺氧/復氧H9C2心肌細胞自噬及其相關基因Atg5、Beclin1 mRNA表達的影響。方法 將體外培養的H9C2心肌細胞隨機分為空白血清組(CG)、缺氧/復氧組(HRG)、加味丹參飲含藥血清組(JDG)、JDG+自噬抑制劑(3-MA)組(JIG)、JDG+自噬激動劑(RAPA)組(JAG)。倒置顯微鏡觀察各組心肌細胞生長及形態變化；MTT比色法測定心肌細胞存活率；透射電子顯微鏡觀察心肌細胞自噬體形態及數量；實時熒光定量PCR檢測自噬相關基因Atg5、Beclin1 mRNA表達。結果 與CG比較，HRG鏡下心肌細胞變性壞死程度增加，細胞存活率下降(P<0.01)，電鏡下自噬體增多，實時熒光定量PCR示Atg5、Beclin1 mRNA表達上調；與HRG相比，JDG及JAG鏡下心肌細胞變性壞死程度減輕，細胞存活率顯著升高(P<0.01)，電鏡下自噬體增加，Atg5、Beclin1 mRNA表達進一步上調(P<0.05)。結論 加味丹參飲預處理通過上調自噬相關基因Atg5、Beclin1 mRNA表達，增強細胞自噬，保護缺氧/復氧損傷H9C2心肌細胞。

加味丹參飲含藥血清；H9C2心肌細胞；缺氧/復氧損傷；自噬；Atg5 mRNA；Beclin1 mRNA

隨著靜脈溶栓、經皮冠狀動脈腔內成形術等方法治療急性心肌梗死的廣泛開展，急性心肌梗死患者的預后得到明顯改善。但是隨之而來的心肌缺血再灌注(IR)損傷卻嚴重制約著上述方法的救治成功率，因此，心肌IR損傷機制及心肌保護的研究一直是當今研究熱點之一。自噬對維持正常心臟形態和心肌功能起到重要作用，在心肌IR損傷過程中扮演重要角色〔1〕。益氣活血中藥復方加味丹參飲對IR損傷心肌細胞具有保護作用，通過抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等途徑抗心肌細胞損傷〔2～4〕。本研究在此基礎上觀察加味丹參飲含藥血清預處理對缺氧/復氧H9C2心肌細胞自噬及其相關基因Atg5、Beclin1 mRNA表達的影響，進一步探討該方抗心肌細胞IR損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株和實驗動物 H9C2(2-1)大鼠心肌細胞株購自中國科學院上海細胞庫。清潔級雄性SD大鼠40只，體質量250～280 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SYXK(湘)2013-0005，飼養于湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心，用于制備動物血清。

1.2 藥物 加味丹參飲中藥購自湖南中醫藥大學附屬第一醫院中藥房。水煎2次，合并煎液，過濾濃縮至2 g生藥/ml，置于4℃冰箱備用。

1.3 主要試劑與儀器 3-甲基腺嘌呤(3-MA,S24823-1g 上海源葉),雷帕霉素(Rapamycin，S17098-100 mg 上海源葉)。高糖(4.5 g/L)DMEM(SH30022.01，Hyclone)，胎牛血清(blz-000211,GIBCO)，0.25%胰酶-EDTA(blz-0193，GIBCO)，青鏈霉素混合液(10378，GIBCO)，DMSO(D2650，Sigma)，MTT(MT120C，Spectrum)，PBS(blz-0099，Solarbio)，qRT-PCR引物由上海生工生物技術有限公司提供。Trizol(Sigma)，mRNA逆轉錄試劑盒(Takara)，SYBR Premix Ex Taq(Takara)，CO2細胞培養箱(HF160W,力康)，超凈工作臺(JB-CJ-2B，常州普天儀器)，倒置顯微鏡(XD-202，上海)，酶標儀(BioTek,美國)，PCR儀(2400 PCR System,perkin Elmer)，Real-time PCR儀(7900 HT System,ABI),臺式低速微量離心機(Eppendorf)，日立H7700透射電鏡。

1.4 加味丹參飲含藥血清制備 40只SD大鼠隨機分為空白血清組和含藥血清組，每組20只。加味丹參飲按臨床體表面積換算，相當于人臨床用藥劑量的8倍〔5〕。含藥血清組大鼠以生藥59.28 g/kg、2次/d灌胃，連續7 d；空白血清組給予等體積蒸餾水灌胃。于末次給藥后1 h,無菌條件下，腹主動脈插管取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清。56℃滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌,分裝,-20℃冰箱保存備用。使用前用DMEM培養基稀釋成體積分數含藥血清。

1.5 H9C2(2-1)大鼠心肌細胞培養與傳代 將H9C2(2-1)大鼠心肌細胞用培養液(90%高糖DMEM液+10%胎牛血清+1% 青鏈霉素)在37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養，24 h更換培養液，待細胞匯合率達80%時用0.25% 胰蛋白酶消化收集細胞并傳代。

1.6 缺氧/復氧細胞模型的建立 參照《藥理實驗方法學》〔6〕和本課題組建立的模型進行實驗〔7〕。DMEM培養液用高純氮氣飽和30 min，使培養液氧分壓低于4.0 kPa(30 mmHg)，得缺氧培養液。心肌細胞單層換用缺氧培養液后，培養液內立即充入氮氣(1 L/min流量)30 s以驅除瓶內氧氣，然后塞緊瓶塞密閉培養。缺氧不同時間后可造成心肌細胞不同程度的損害。按此方法造成心肌細胞缺氧，缺氧2 h后換用正常培養液培養3 h，造成再給氧損傷。

1.7 分組及給藥 取對數生長期H9C2心肌細胞，隨機分為5組，每組6孔，①空白血清組(CG)：在含15%空白血清培養液中常規培養29 h；②缺氧/復氧組(HRG)：在含15%空白血清培養液中常規培養24 h，更換缺氧培養液，缺氧2 h，再給氧3 h；③加味丹參飲含藥血清組(JDG)：在含15%藥物血清中常規培養24 h，缺氧2 h，再給氧3 h；④ JDG+自噬抑制劑(3-MA)組(JIG)：3-甲基腺嘌呤(10 mmol/L)預處理30 min，余同③；⑤JDG+自噬激動劑(RAPA)組(JAG)：雷帕霉素(100 nmol/L)預處理30 min，余同③。

1.8 MTT法測定不同濃度含藥血清對H9C2心肌細胞存活率的影響 取對數生長期H9C2(2-1)心肌細胞制成單細胞懸液后，以5×104個/ml密度接種于96孔板，每孔100 μl，貼壁后換為6個不同濃度含藥血清(5%、10%、15%、20%、25%、30%)，空白對照組加入等量含正常血清的DMEM培養液，24 h后各孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl,常規培養4 h后吸棄孔內液體，每孔加入DMSO 150 μl,低速振蕩10 min混勻，酶標儀在波長為490 nm時測定吸光度(OD值)。細胞存活率(%)=(給藥孔OD值-調零孔OD值)/(空白孔OD值-調零孔OD值)×100%。

1.9 倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞生長及形態變化 倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞生長及形態變化并拍照。

1.10 MTT法檢測加味丹參飲含藥血清對缺氧/復氧心肌細胞存活率的影響 取對數生長期H9C2心肌細胞制成單細胞懸液后，以5×104個/ml密度接種于96孔板，每孔100 μl，每組設6個復孔，貼壁后按上述方式分組給藥，酶標儀測定吸光度值。

1.11 透射電子顯微鏡觀察各組心肌細胞內自噬體形態及數量 各組細胞經上述處理后，收集細胞，加入2.5%戊二醛溶液固定過夜(4℃)，次日用磷酸鹽緩沖液洗滌4次，15 min/次，1%鋨酸溶液4℃固定2 h后梯度丙酮脫水(50%、70%、90%、100%)，依次經滲透、包埋、聚合、切片、染色等步驟后用透射電鏡觀察自噬體形態及數量多少。

1.12 實時熒光定量PCR 檢測Atg5、Beclin1 mRNA表達 收集培養細胞，按Trizol試劑盒方法提取細胞總RNA，檢測RNA純度及濃度。按逆轉錄試劑盒方法將RNA逆轉錄為cDNA，并以cDNA作為模板，用實時熒光定量PCR儀進行擴增。PCR擴增條件：預變性95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。以β-actin為內參，采用2-△△Ct法對對結果進行分析，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因，△△Ct=△Ct處理組-△Ct對照組。差別倍數=2-△△Ct，正常對照組的數值設為1。引物序列：β-actin：5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'和5'-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'；Beclin-1：5'-CTCGTCAAGGCGTCACTTCT-3' 和5'-CCTTAGACCCCTCCATTCCTC-3'；Atg5：5'-TGAGCCTGACCTTGCTTCAG-3'和5'-GTGCCTGTTAATCGGACATGG-3'。

1.13 統計學分析 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊采用非參數檢驗。

2 結 果

2.1 MTT法測定不同濃度加味丹參飲含藥血清對細胞存活率的影響 與CG〔(95.10±1.83)%〕比較，各組細胞存活率均降低(P<0.01)，其中，5%含藥血清組〔(84.09±5.55)%〕、20%含藥血清組〔(82.75±5.55)%〕、25%含藥血清組〔(59.61±5.55)%〕及30%含藥血清組〔(41.47±8.71)%〕細胞存活率顯著降低，而10%含藥血清組〔(91.10±8.71)%〕及15%含藥血清組〔(89.43±5.54)%〕細胞存活率差異無無統計學意義(P>0.05)，且較5%、20%、25%、30%含藥血清組細胞存活率升高(P<0.01)，故選用15%含藥血清為最佳工作濃度。

2.2 加味丹參飲含藥血清對缺氧/復氧心肌細胞生長及形態變化的影響 倒置顯微鏡下，CG細胞貼壁生長，呈梭形，折光性大，培養液中見極少量的細胞懸浮；HRG鏡下見大量細胞懸浮，細胞形態不規則，折光性降低，細胞間空隙增大，胞質中有空泡及顆粒；JDG及JAG細胞形態較HRG明顯改善；JIG細胞形態與HRG相似，見圖1。

圖1 加味丹參飲含藥血清對缺氧/復氧心肌細胞生長及形態變化的影響(×400)

2.3 加味丹參飲含藥血清對缺氧/復氧心肌細胞存活率的影響 與CG〔(94.84±0.43)%〕比較，各組細胞存活率均降低(P<0.01)，其中，JDG〔(86.84±1.0)%〕及JAG〔(86.90±1.24)%〕組間細胞存活率比較差異無統計學意義(P>0.05)；與HRG〔(41.94±1.50)%〕比較,JDG及JAG細胞存活率均顯著升高(P<0.01)，而JIG(41.95±1.86 %)差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 透射電子顯微鏡觀察各組心肌細胞內自噬體形態及數量 CG胞質內未見明顯自噬體形成；缺氧2 h、復氧3 h后(HRG)胞質內出現少量包含胞質內容物的膜狀結構(自噬體)；予加味丹參飲預處理后(JDG)自噬體數量增多；加用自噬激動劑后(JAG)自噬體數目進一步增加，予自噬抑制劑后(JIG)自噬體數量減少，見圖2。

2.5 加味丹參飲含藥血清對缺氧/復氧心肌細胞自噬相關基因Atg5、Beclin1 mRNA表達的影響 與CG比較，各組Atg5 mRNA相對表達量均升高(P<0.01)；與HRG比較，JDG及JAG組間Atg5 mRNA相對表達量進一步升高(P<0.05)，而JIG差異無統計學意義(P<0.05)。與CG比較，除JIG，其余各組Beclin1 mRNA相對表達量均升高(P<0.01)；與HRG比較，JDG及JAG進一步升高(P<0.05)，見圖3。

圖2 加味丹參飲含藥血清對缺氧/復氧心肌細胞自噬體形態及數量的影響(×10 000)

與CG比較：1)P<0.01，與HRG比較：2)P<0.01 圖3 加味丹參飲含藥血清對缺氧/復氧心肌細胞自噬相關基因Atg5、Beclin1 mRNA表達的影響

3 討 論

自噬是溶酶體介導的細胞內容物被降解及循環利用的過程，廣泛存于真核生物中，對維持細胞的穩態起重要作用〔8，9〕，且參與機體包括感染、腫瘤、神經退行性病變、心肌缺血再灌注損傷等在內的多種病理生理過程。作為真核生物中保守的降解途徑，細胞自噬是機體在饑餓條件下的一種存活機制，可在多種類型脅迫期間保護細胞，研究表明急性或慢性心肌缺血中自噬均增加，通過降解胞質內長壽命蛋白等，為關鍵的生命活動提供所需的營養物質，從而發揮心肌保護作用。然而，自噬也可參與一種與凋亡截然不同的程序性細胞死亡(Ⅱ型程序性死亡)。在心肌再灌注階段，自噬程度進一步增強，對于自噬在心肌IR損傷中起保護作用還是損傷作用目前尚無統一定論。Decker等〔10〕觀察到，在再灌注心肌細胞內自噬泡增多，且自噬泡內含有受損傷的線粒體，提示由自噬上調介導的心肌保護作用可能與其清除受損線粒體有關。然而，有研究發現，在體外培養的心肌細胞采用缺氧再給氧模擬缺血再灌注時，用siRNA阻斷Beclin1或用PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤抑制自噬，可減少再灌注時心肌細胞的死亡〔11〕。本研究表明，體外培養H9C2心肌細胞缺氧2 h，再給氧3 h后自噬泡增多，但心肌細胞存活率降低，心肌細胞損傷加重，予加味丹參飲預處理24 h后再予缺氧再給氧處理，自噬泡結構進一步增多，并伴隨心肌細胞存活率增加，心肌細胞生長及損傷程度改善，提示在此模型中加味丹參飲通過上調自噬保護缺氧/復氧損傷H9C2心肌細胞。

自噬是受到嚴密調控的動態過程，包括自噬的誘導、運載物的識別和包裝、囊泡成核、囊泡擴展和閉合、Atg蛋白循環、囊泡與液泡/溶酶體融合、囊泡分解，以及所產生的大分子物質的循環利用。其中，Atg5通過形成Atg12-Atg5-Atg16復合物主要定位于吞噬泡的外側，在自噬體形成期間驅動膜片的擴展和/或彎曲，是參與調控自噬的重要基因。Beclin1與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-激酶(Vps34)形成Beclin1/Vps34復合物，通過使其他Atg蛋白重定位于前自噬體結構而促進自噬體的形成，3-甲基腺嘌呤可通過干擾Beclin1復合物中hVps34的活性來抑制自噬。Boya等〔12〕研究發現，采用敲除或沉默Atg基因(Atg5、Atgl0、Atgl2及Beclin1)或使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)、羥氯喹、渥曼青霉素等藥物抑制自噬均可增加營養匱乏環境中細胞的凋亡和死亡。本研究顯示，采用實時熒光定量PCR檢測各組心肌組織Atg5及Beclin1 mRNA表達，加味丹參飲組較缺氧/復氧組Atg5及Beclin1 mRNA表達均上調，加用自噬激動劑雷帕霉素后表達進一步上調，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可下調Atg5及Beclin1 mRNA表達，此實驗結果與電子顯微鏡下自噬泡數量變化相一致，表明Atg5及Beclin1基因參與了自噬體的形成。

心肌 IR 損傷屬于中醫“胸痹”、“真心痛”范疇。史載祥教授〔13〕認為冠狀動脈血瘀阻絡與微循環障礙是心肌IR損傷和再灌注治療后的重要病理生理機制，活血化瘀成為研究后再灌注時代難題的主要途徑。結合中醫氣血理論：“氣能生血，血為氣母”、“氣為血帥”，益氣活血法成為中醫防治心肌IR損傷的重要治則。本研究所用加味丹參飲即以益氣活血法立法組方，課題組前期研究顯示該方可通過抗氧化，抗炎癥，抗凋亡等途徑抗心肌細胞損傷〔2～4〕，本研究進一步表明該方可通過調節自噬抗H9C2心肌細胞損傷。劉杰民等〔14〕認為細胞自噬是機體正氣虧虛下的自救方式，是體內內生瘀血痰濁之邪的自我清除途徑；李欣志等〔15〕提出心肌細胞自噬可能是心臟陰陽自和的微觀基礎。因此，氣虛(屬陽，細胞自噬功能下降)血瘀(屬陰，細胞凋亡和死亡上升)可導致心肌細胞自我保護功能下降，從益氣活血角度出發，激發心肌細胞自噬，調節心臟陰陽自和，可能是中醫藥防治心肌IR損傷的新靶點。

綜上所述，益氣活血中藥復方加味丹參飲預處理對缺氧/復氧損傷H9C2心肌細胞具有延遲保護作用，該機制可能與其上調自噬相關基因Atg5及Beclin1 mRNA表達，上調自噬水平相關。但自噬對細胞的生存具有雙重作用，如何通過精細調控自噬減輕心肌缺血再灌注損傷仍需進一步深入探究。

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〔2016-10-19修回〕

(編輯 李相軍)

Influence of preconditioning with Jiawei Danshen decoction on expression level of autophagy related gene Atg5 and Beclin1 in H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury

RAO Chun-Mei,CHENG Xi-Hua,REN Ting,etal.

Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China

Objective To investigate the influence of preconditioning with Jiawei Danshen decoction on expression level of autophagy related gene Atg5 and Beclin1 in H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury.Methods H9C2 cardiomyocytes cultured in vitro were randomly divided into control group(CG),hypoxia/reoxygenation group(HRG),Jiawei Danshen decoction group(JDG),JDG+3-methyladenine(a inhibitor of autophagy) group(JIG) and JDG +Rapamycin(RAPA)(an agonists of autophagy)group (JAG).The inverted microscope was used to observe cell growth and morphological changes.The cell viability of H9C2 cardiomyocytes were measured by MTT assay.Transmission electron microscope was applied to observe the changes of autophagosome formation in cardiomyocytes.The expression levels of Atg5 and Beclin1 mRNA were determined by qRT-PCR.Results Compared with those of CG,the degree of cell necrosis and damage were rised in HRG,the cell viability was declined(P<0.01),the autophagosome formation in cardiomyocytes was increased.Meanwhile,the expression levels of Atg5 and Beclin1gene were up-regulated compared with those of HRG,the cardiomyocyte morphological structure of JDG and JAG were improved,the cell viability of JDG and JAG were increased significantly(P<0.01),the autophagosome formation in cardiomyocytes were increased.In addition,the expression levels of Atg5 and Beclin1gene were up-regulated(P<0.05).Conclusions Preconditioning with Jiawei Danshen decoction has a protective effect on H9C2 cardiomyocytes during hypoxia/reoxygenation injury by up-regulating the expression levels of Atg5 and Beclin1gene.

Jiawei Danshen decoction medicated serum;H9C2 cardiomyocytes;Hypoxia/reoxygenation injury;Autophagy;Atg5 mRNA；Beclin1 mRNA

國家自然科學基金資助項目(81373576，81503536);湖南省中醫藥管理局重點課題(201304);湖南省教育廳項目(14B136，14C0872);湖南省科技廳一般項目(2014SK3034);湖南省教育廳優秀青年項目(14B136);中西醫結合防治心腦疾病的相關基礎研究湖南省高校科技創新團隊科研項目

成細華(1974-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中醫藥防治糖尿病及其并發癥的研究。 黃政德(1955-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事心血管疾病的中醫藥防治研究。

饒春梅(1989-)，女，在讀碩士，主要從事中醫藥防治糖尿病及其并發癥的研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1821-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.001