miR-301a促進人結腸癌細胞株HT29細胞侵襲與轉移的機制

徐 虎 包樂群 呂勝啟

(華中農業大學醫院，湖北 武漢 430070)

miR-301a促進人結腸癌細胞株HT29細胞侵襲與轉移的機制

徐 虎 包樂群1呂勝啟2

(華中農業大學醫院，湖北 武漢 430070)

目的 探討miR-301a對結腸癌侵襲轉移的影響及分子機制。方法 實時熒光定量PCR檢測40例結腸癌患者癌組織中miR-301a的表達水平，探究結腸癌和miR-301a表達的關系。同時在人結腸癌細胞株HT29細胞過表達和干擾miR-301a，MTT法檢測miR-301a對HT29細胞增殖的影響。蛋白免疫技術和實時熒光定量PCR在分子水平上檢測miR-301a表達對HT29細胞中侵襲相關分子的表達水平，探究miR-301a調控下的轉化生長因子(TGF)-β/Smad4/基質金屬蛋白酶(MMP)-9信號通路對結腸癌侵襲轉移的影響。結果 實時熒光定量PCR結果顯示40例結腸癌患者癌組織中miR-301a的表達水平明顯升高，且隨著腫瘤分期分級的升高，其水平明顯升高。MTT法檢測發現過表達miR-301a的HT29細胞數量明顯增加，而干擾miR-301a則細胞數目減少，表明miR-301a可促進結腸癌細胞的增殖。在分子水平上蛋白免疫技術和實時熒光定量PCR檢測結果顯示miR-301a通過下調TGF-β和Smad-4的表達，促進MMP-9的表達，最終促進癌細胞的侵襲轉移。結論 miR-301a通過下調TGF-β/Smad4信號通路，促進MMP-9的表達，最終促進結腸癌的侵襲轉移。

miR-301a；結腸癌；基質金屬蛋白-9；侵襲；轉移

目前結腸癌的發病率逐年攀升，預后和5年生存率主要取決于癌細胞轉移與否。轉化生長因子(TGF)-β作為分泌蛋白，介導絲氨酸/蘇氨酸激酶受體后的信號通路〔1，2〕，參與TGF-β/Smad信號通路的調控〔3〕。TGF-β/Smad信號通路已被證明參與多種癌癥的致癌作用，如誘導癌細胞的增殖、分化、遷移以及上皮細胞的間質化〔4〕。miR-301a作為原癌基因，其表達失調可影響到眾多腫瘤的發生，目前miR-301a在不同腫瘤中的表達和作用尚存在爭議〔5〕。有研究發現，miR-301a通過下調Smad4的表達促進胰腺癌的發生。miR-301a通過調節AR/TGF-β1/Smad/基質金屬蛋白酶(MMP)-9信號通路促進前列腺癌的侵襲和轉移〔6〕。此外，miR-301a是阿霉素耐藥性骨肉瘤的潛在生物標志物，借助調控miR-301a的表達改善骨肉瘤的阿霉素耐藥性〔7〕。miR-301a的高表達通常與三陰性乳腺癌預后不良相關〔8〕。但是對于miR-301a在結腸癌中的表達及作用目前尚無文獻報道，本研究旨在探討miR-301a在人結腸癌細胞株HT29細胞侵襲與轉移中的作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設備 細胞培養超凈臺和細胞培養箱(Thermo Scientific公司)，微量移液器(Eppendorf公司)，PCR儀(Bio-Rad公司)，實時熒光定量PCR系統ABI7500(Applied Biosystems公司)。

1.2 主要試劑和材料 胎牛血清(Ausgene公司)，DMEM培養基(Life technology)，Lipo2000 (Invitrogen)，opti-MEM培養基(Gibco)，RIPA裂解液(碧云天)，Trizol(Invitrogen公司)，焦碳酸二乙酯(DEPC)水(sigma)，反轉錄試劑盒(Invitrogen公司)，SYBR green (羅氏)。miRNA-301a前體片段及陰性對照片段，miRNA-301a anti-sense片段及陰性對照片段均購自Ambion公司，且經上海生工公司測序鑒定。miR-301a、Smad-4和MMP-9引物使用primer 5.0設計并由生工合成，miR-301a正義：5′-CTATGCCCGTATTGACGGCCAT-3′,反義：5′-CGAACGTGGTTCGTACGGGTAA-3′;Smad-4正義：5′-AGGCTTGCATTGCAACGGTTCAC-3′,反義：5′-TGACGTCTTGCACTCGGACCTGCC-3′;MMP-9正義：5′-CCCAAACGTGGTCCGTACCGTC-3′,反義：5′-TCGCCAGTTTGCCCGTACGCG-3′;GAPDH正義：5′-GACCCGATCCTGGAACTGATTAG-3′,反義：5′-GGGACCTTGCTTTGCATCGACC-3′。

1.3 樣本來源 選取2013年9月至2014年12月在武漢市華中農業大學醫院普外科室住院的結腸癌患者40例為實驗組，其中男25例，女15 例，年齡47～72歲。所有入組患者的腫瘤分期和分級均參照AJCC/UICC頒布的結直腸癌的腫瘤分期和分級標準，結腸癌Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ期10例，Ⅳ期9例，所有患者病情穩定，無腫瘤出血、腸穿孔、腸梗阻、急慢性感染等并發癥。另選取結腸癌I期患者癌旁手術組織作為對照組。

1.4 細胞培養和細胞轉染 人結腸癌細胞株HT29細胞購自中科院上海細胞庫，細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，置于37℃ 5% CO2的培養箱中。同時取對數生長期HT29細胞進行轉染，轉染miR-301a前體片段、miR-301a anti-sense片段及陰性對照片段作為過表達組、干擾組和對照組。轉染方法按照Life technology公司的Lipo 2000說明書操作。轉染48 h后，提取細胞總RNA進行實時熒光定量PCR檢測HT29細胞中miR-301a過表達及干擾情況，同時提取RNA檢測相關基因在mRNA水平的表達量。

1.5 噻唑藍(MTT)法檢測miR-301a對HT29細胞數量的影響 細胞轉染24 h后，用Tripsin-EDTA消化細胞制成細胞懸液，將細胞懸液接種于96孔培養板中，每孔5×103個細胞，100 μl/孔。細胞貼壁后再培養12 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制5 mg/ml MTT溶液，每孔加20 μl，注意保持避光繼續孵育4 h，小心吸棄孔內培養上清液，每孔避光加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)充分融解結晶物，在酶聯免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值，計算細胞的相對數量。

1.6 實時熒光定量PCR 結腸癌腫瘤組織以及HT29細胞的總RNA用Invitrogen公司Trizol提取，具體步驟包括Trizol室溫裂解、氯仿沉降蛋白、異丙醇沉淀RNA，75%酒精(DEPC水配制)洗滌RNA、DEPC水溶解RNA，最后檢測RNA純度及濃度。按照M-MLV reverse transcriptase逆轉錄系統對結腸癌腫瘤組織以及HT29細胞的總RNA進行反轉錄得到cDNA。使用SYBR Green進行實時熒光定量PCR檢測miR-301a、Smad-4和MMP-9在mRNA水平上的含量。

1.7 統計學方法 應用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR檢測結腸癌組織中miR-301a的表達水平 結腸癌患者癌組織中miR-301a表達明顯高于對照組，且隨著結腸癌分級分期的升高，miR-301a表達水平亦升高，這表明miR-301a和結腸癌的發生具有一定的機制關聯。見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR檢測結腸癌組織中 miR-301a的表達水平

2.2 實時熒光定量PCR檢測HT29細胞過表達和干擾MiR-301a表達效果 對照組miR-301a表達為1.16±0.97，miR-301a前體片段可明顯上調HT29細胞中miR-301a的表達水平(3.39±1.04)，同時miR-301a anti-sense片段通過結合降解miR-301a，減少HT29細胞中miR-301a的水平(0.47±0.09)，表明miR-301a前體片段和miR-301a anti-sense片段具有明顯的調控表達的效果。

2.3 MTT法檢測miR-301a對HT29細胞增殖的影響 miR-301a過表達組HT29細胞數量(5.07±1.31)明顯多于對照組(1.15±0.82)，表明miR-301a可能參與促進結腸癌細胞的增殖。同時干擾miR-301a表達的HT29細胞數量(0.42±0.06)則明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，更加明確了miR-301a在HT29細胞增殖中的作用。

2.4 實時熒光定量PCR檢測miR-301a對侵襲相關分子表達水平的影響 對照組TGF-β、Smad-4、MMP-9 mRNA表達1.19±0.46，1.12±0.37，1.26±0.52，過表達miR-301a可下調TGF-β、Smad-4 mRNA水平(0.48±0.02，0.43±0.02)，同時上調MMP-9 mRNA的表達(4.98±1.06)，這表明miR-301a可能通過下調TGF-β/ Smad4信號通路，促進MMP-9的表達，最終提高細胞外基質的降解速率，促進癌細胞的侵襲轉移。干預組TGF-β、Smad-4、MMP-9 mRNA表達量3.72±1.02，2.51±0.98，0.39±0.01。

3 討 論

miRNAs是一類保守的、短小的非編碼RNA，miRNAs一般全長約19～22個核苷酸，其主要通過轉錄后調節，即結合靶基因的信使RNA在翻譯水平調節靶基因的表達，進而參與調控細胞的增殖、凋亡和分化。此外miRNAs在代謝綜合征，各種腫瘤的發病中具有誘導作用，尤其是在腫瘤細胞中，miRNAs可作為癌基因或抑癌基因調控腫瘤的侵襲、轉移和血管生成〔9〕。研究顯示在乳腺癌以及肺癌腫瘤組織中miRNAs作為抑癌基因，其表達多降低，在結腸癌以及肝癌組織中有些miRNAs作為原癌基因其表達多升高〔10〕。如miR-205可作為腦膠質瘤的一個有價值的生物標志物，促進膠質瘤的侵襲和轉移〔11〕；miR-940通過直接調控ZNF24的表達促進胃癌的轉移〔12〕。miRNAs作為重要的轉錄后基因表達的調控者，成為各種細胞過程中的關鍵調控分子，包括細胞分化、自我更新、細胞增殖和凋亡。研究發現miRNAs通過與靶基因的5′非翻譯區相互作用調節靶基因的表達，其可調節超過30%的人類基因轉錄后的表達調控〔13〕。miRNAs可調控許多組織的癌癥進展，研究發現p53突變的腫瘤部分是通過調控miRNAs的表達實現的〔14〕，miR-301a作為癌基因在結腸癌總的致侵襲和致轉移的作用目前還不清楚。通過檢測人結腸癌組織中miR-301a的表達水平發現結腸癌組織中miR-301a常高表達，同時過表達miR-301a的HT29細胞數目增加，而干擾miR-301a表達的HT29細胞則數目減少。且過表達miR-301a的HT29細胞中Smad-4和MMP-9表達升高，促進結腸癌的侵襲和轉移。近期有研究發現，miR-301a可介導Wnt/β-catenin信號在腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移中的作用，β-catenin通過與TCF/LEF基因結合蛋白相互作用，激活含有TCF/LEF元件的miR-301a的表達〔15〕。有研究表明源于腫瘤的miRNA在血液中可免受核糖核酸酶的降解而穩定存在〔16〕。通過本研究發現，miR-301a通過下調SMAD4促進MMP-9的表達水平，最終促進結腸癌細胞的侵襲與轉移。基于miR-301a在結腸癌中的作用，因此miR-301a不是為結腸癌侵襲轉移的一個有價值的生物預警分子，對結腸癌的分期和預后治療具有重要的提示意義。

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〔2016-12-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

湖北省科技廳資助項目(No.30211176)

徐 虎(1969-)，男，主治醫師，主要從事臨床外科研究。

R735.3+5

A

1005-9202(2017)08-1825-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.002

1 湖北省腫瘤醫院肝膽胰科 2 湖北省人民醫院泌尿外科