外源性硫化氫對(duì)大鼠心肺復(fù)蘇后大腦中動(dòng)脈血流、血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶及S-100β蛋白的影響

童世君 金利明 李 祥

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，青海 西寧 810001)

外源性硫化氫對(duì)大鼠心肺復(fù)蘇后大腦中動(dòng)脈血流、血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶及S-100β蛋白的影響

童世君 金利明1李 祥2

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，青海 西寧 810001)

目的 探討外源性給予硫化氫(H2S)對(duì)大鼠心肺復(fù)蘇(CPR)后相關(guān)神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。方法 選取SD大鼠，隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)(Sham)組、CPR組及H2S組(給予H2S干預(yù))，觀察各組神經(jīng)功能評(píng)分、組織病理學(xué)改變、大腦中動(dòng)脈血流值、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及S-100β蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 在神經(jīng)功能評(píng)分方面，復(fù)蘇12 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組評(píng)分顯著降低(P<0.05)。在組織病理學(xué)方面，Sham組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)均完整，細(xì)胞核、核膜及核仁結(jié)構(gòu)也完整。CPR組6 h海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，核仁較清晰，但排列較松散，部分細(xì)胞變性壞死；H2S組6 h病理改變基本同CPR組，無明顯差別，只是變性壞死細(xì)胞較少。CPR組12 h海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，神經(jīng)元缺失嚴(yán)重，核膜界線不清晰；H2S組12 h海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞間隙較寬，但均較CPR組程度降低。復(fù)蘇6及12 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組大腦中動(dòng)脈血流值均顯著降低(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組大腦中動(dòng)脈血流值均顯著升高(P<0.05)。復(fù)蘇6及12 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組NSE及S-100β蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組NSE及S-100β蛋白顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 外源性H2S可以通過調(diào)節(jié)大腦中動(dòng)脈血流、NSE及S-100β蛋白表達(dá)量來加大大鼠CPR后腦保護(hù)作用。

硫化氫；心肺復(fù)蘇；腦損傷；神經(jīng)元特異性烯酰化酶(NSE)；S-100β

心肺復(fù)蘇(CPR)是搶救心臟驟停患者生命的重要措施。腦組織在復(fù)蘇后會(huì)經(jīng)歷缺血性腦損傷和再灌注損傷，伴隨神經(jīng)元死亡，其中CPR后的腦組織損傷是患者死亡的重要原因。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)為檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷的特異性蛋白，其可作為監(jiān)測(cè)CNS損傷較靈敏的指標(biāo)之一；S-100β主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，參與腦組織缺血缺氧重要病程，血清中兩者的含量可作為判斷腦損傷程度的重要指標(biāo)〔1〕。硫化氫(H2S)參與腦組織損傷的保護(hù)過程〔2〕，可減輕CPR后腦水腫的癥狀，然而其在CPR后對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈血流及血清中NSE及S-100β表達(dá)的研究未知。本研究旨在探討H2S是如何通過調(diào)節(jié)顱內(nèi)動(dòng)脈血流、血清中NSE及S-100β蛋白含量來改善CPR后大鼠腦組織損傷。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 北京華阜康生物公司購(gòu)置SD大鼠，雄性，120只，周齡：10～12 w，體重300～400 g，隨機(jī)分為3組，每組40只，即假手術(shù)(Sham)組、CPR組、H2S組。Sham組僅行麻醉、動(dòng)靜脈置管、氣管插管，不建立心臟驟停及CPR模型；CPR組建立心臟驟停模型，復(fù)蘇前1 min靜脈給予0.5 ml生理鹽水；H2S組建立CPR模型，復(fù)蘇前1 min靜脈給予硫氫化鈉(NaHS)溶液0.5 ml(NaHS 10 μmol/kg)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在操作后6 h及12 h采集樣本，監(jiān)測(cè)大腦動(dòng)脈血流，取腦組織及血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑盒儀器 動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)于美國(guó)CWE公司，血管張力測(cè)定儀器及多普勒血流檢測(cè)儀購(gòu)于Sigma公司，精密酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Clover公司，動(dòng)物心電監(jiān)護(hù)儀購(gòu)于Philips公司，NSE及S-100β蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)于美國(guó)ADL公司。

1.3 動(dòng)物模型構(gòu)建 建立心臟驟停模型〔3〕。7.2%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定，監(jiān)測(cè)心電圖(ECG)，行股動(dòng)、靜脈置管，監(jiān)測(cè)心率等變化，再行氣管插管后連接呼吸機(jī)。插管后穩(wěn)定10 min，在呼氣末夾閉氣管插管誘導(dǎo)出心臟驟停模型，指證為：心電圖顯示室顫、心跳停止；收縮壓25 mmHg以下。氣管插管關(guān)閉8 min后行CPR操作，靜脈注入腎上腺素(40 μg/kg)，并打開氣管插管，呼吸機(jī)給氣，胸外按壓。復(fù)蘇成功的指標(biāo)為：恢復(fù)動(dòng)脈波形，收縮壓大于40 mmHg，自助循環(huán)恢復(fù)。1 h后結(jié)扎動(dòng)靜脈及器官，縫合皮膚，完成模型構(gòu)建。

1.4 檢測(cè)大腦中動(dòng)脈血流數(shù)值 模型建立后6及12 h，應(yīng)用皮氧分壓監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)大腦中動(dòng)脈血流值，連續(xù)1 h監(jiān)測(cè)并記錄。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分 在大鼠自主功能恢復(fù)后6及12 h對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，分值越高說明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重〔3〕。

1.6 腦組織病理形態(tài)檢測(cè) 在模型建立后6及12 h斷頭取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，包埋，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腦組織形態(tài)。

1.7 NSE及S-100β蛋白含量檢測(cè) 在模型建立后6及12 h，對(duì)大鼠進(jìn)行眼球取血，靜置2 h后高速離心取血清置于深凍冰箱備用。應(yīng)用ELISA測(cè)定NSE及S-100β含量，取冷凍血清，4℃解凍，應(yīng)用NSE試劑盒及S-100β試劑盒。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書，預(yù)包被孔板，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品孔，將樣品血清加入樣品孔，加檢測(cè)抗體，加生物素標(biāo)記抗體，室溫孵育，洗板，加入抗生物素蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶，室溫孵育，洗板，顯色液加入，室溫避光孵育15 min，加入終止液，酶標(biāo)儀讀數(shù)，檢測(cè)血清中兩種蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分 復(fù)蘇6 h后，3組神經(jīng)功能評(píng)分沒有顯著差異(P>0.05)。復(fù)蘇12 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.2 各組大腦中動(dòng)脈血流值變化 復(fù)蘇6 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組大腦中動(dòng)脈血流值顯著降低(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組大腦中動(dòng)脈血流值顯著升高(P<0.05)。復(fù)蘇12 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組大腦中動(dòng)脈血流值顯著降低(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組大腦中動(dòng)脈血流值顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3 各組NSE蛋白變化 復(fù)蘇6 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組NSE蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組NSE蛋白量顯著降低(P<0.05)。復(fù)蘇12 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組NSE蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組NSE蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.4 各組S-100β蛋白變化 復(fù)蘇6 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組S-100β蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組S-100β蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。復(fù)蘇12 h后，與Sham組相比，CPR組及H2S組S-100β蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與CPR組相比，H2S組大鼠S-100β蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能評(píng)分、大腦中動(dòng)脈血流值、NSE、S-100β水平

與Sham組比較：1)P<0.05;與CPR組比較：2)P<0.05

2.5 各組組織病理學(xué)改變 Sham組各時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)均完整，細(xì)胞核、核膜及核仁結(jié)構(gòu)也完整。CPR組6 h海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，核仁較清晰，但排列較松散，部分細(xì)胞變性壞死；H2S組6 h病理改變基本同CPR組，無明顯差別，只是變性壞死細(xì)胞較少。CPR組12 h海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，神經(jīng)元缺失嚴(yán)重，核膜界線不清晰；H2S組12 h海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，神經(jīng)元變性壞死，細(xì)胞間隙較寬，但均較CPR組程度降低。見圖1。

圖1 各組海馬組織病理學(xué)觀察(HE，×400)

3 討 論

以往認(rèn)為H2S是一種有毒性氣體，可干擾機(jī)體的多項(xiàng)生理功能，然而近年來研究發(fā)現(xiàn)正常組織也可分泌一定量的H2S，其作為一種新型的氣體信號(hào)分子參與機(jī)體正常功能中〔4〕。H2S因較高的脂溶性，極易穿透生物膜及血腦屏障，在治療疾病方面有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。H2S可通過抑制多種有毒物質(zhì)介導(dǎo)的氧化損傷及細(xì)胞毒性，清除體內(nèi)多種氧化應(yīng)激產(chǎn)物〔5〕；H2S還可誘導(dǎo)谷胱甘肽的合成，激活鉀及氯通道誘導(dǎo)神經(jīng)元免于谷氨酸的侵害〔6〕，因此H2S可從多個(gè)方面發(fā)揮腦細(xì)胞神經(jīng)保護(hù)作用，已有研究發(fā)現(xiàn)H2S可以減低CRP后的腦損害〔7，8〕。

心臟驟停后，供應(yīng)顱內(nèi)多條血管的血流量急劇降低，顱內(nèi)的缺血缺氧使體內(nèi)酸堿失衡，氧自由基及鈣離子沉積，從而導(dǎo)致細(xì)胞的大量變性壞死〔9，10〕。本研究說明從動(dòng)物行為學(xué)可以看出H2S干預(yù)可以顯著改善機(jī)體的顱內(nèi)神經(jīng)損傷。從組織病理方面可以發(fā)現(xiàn)H2S可以顯著提高神經(jīng)保護(hù)作用。本文結(jié)果提示H2S可以通過加大顱內(nèi)血流量來緩解腦損傷。

NSE是多由神經(jīng)元細(xì)胞分泌，是CNS特異性蛋白，正常情況下血清中無法被檢測(cè)到，但當(dāng)顱內(nèi)出現(xiàn)多種損傷缺血缺氧時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)的NSE即被釋放入血，可作為顱內(nèi)損傷的標(biāo)志物〔11〕；S-100β限制性表達(dá)于多種腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞，可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝多種功能，參與顱內(nèi)缺血缺氧的多種病理過程中，被認(rèn)為是腦損傷的特異性標(biāo)記蛋白〔12〕。本文結(jié)果說明H2S可通過降低多種腦損傷標(biāo)志蛋白改善CPR后的腦功能。已有研究表明，H2S可以通過降低氧化應(yīng)激、凋亡、炎性因子的分泌，改善顱內(nèi)水腫，增加膠質(zhì)細(xì)胞分泌的多種神經(jīng)遞質(zhì)，提高顱內(nèi)腦血流量等方面來改善大鼠的腦缺血損傷〔8〕；H2S還可通過抑制神經(jīng)元的凋亡從而達(dá)到改善新生兒缺氧缺血性腦損傷的病情，通過抗凋亡和抗氧化應(yīng)激改善肝及心臟的再灌注損傷〔13〕，均提示H2S可通過多種途徑等保護(hù)顱內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞從而達(dá)到腦保護(hù)的作用。國(guó)內(nèi)已有研究發(fā)現(xiàn)，H2S可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，減輕腦水腫，從而改善心臟驟停CPR后的腦損傷〔14〕。本實(shí)驗(yàn)說明H2S可以通過增加顱內(nèi)血流量，降低多種顱內(nèi)損傷蛋白的表達(dá)從而改善心臟驟停CPR后的腦損傷。

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〔2015-11-13修回〕

(編輯 王一涵)

青海省科技廳資助項(xiàng)目(2013-N-535)

童世君(1970-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事危重病研究。

R541.7+8

A

1005-9202(2017)08-1843-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.009

1 青海大學(xué)附屬醫(yī)院急救中心 2 青海省人民醫(yī)院麻醉科