8周游泳運動對糖尿病大鼠模型主動脈血管內皮細胞功能的影響

黃玫梅 尚畫雨 夏 志 蘇全生

(成都體育學院運動醫學系，四川 成都 610041)

8周游泳運動對糖尿病大鼠模型主動脈血管內皮細胞功能的影響

黃玫梅 尚畫雨1夏 志2蘇全生

(成都體育學院運動醫學系，四川 成都 610041)

目的 探討長期游泳運動對2型糖尿病(T2DM)大鼠血管內皮細胞的影響及可能機制。方法 8周齡雄性Wistar大鼠高糖高脂飼料喂養聯合鏈脲佐菌素(STZ)注射制備成T2DM大鼠模型后，隨機分為空白對照組(C組)、單純運動組(CE組)、糖尿病對照組(DM組)、糖尿病運動組(DME組)。CE組、DME組進行8 w游泳訓練(6 d/w)，第1周前3 d練習時間分別為20、30和45 min，第4天起每天持續游泳60 min。運動8 w后測定各組血漿中血管性假性血友病因子(vWF)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)，以及胸主動脈中二酯酰甘油(DAG)、蛋白激酶C(PKC)的水平。結果 與DM組相比，DME組的血漿vWF、PAI-1含量以及胸主動脈中PKC活性均明顯降低(P<0.05)，而DAG水平也有所降低，差異無統計學意義(P>0.05)。結論 8 w游泳運動可降低vWF、PAI-1水平，減輕DM造成的血管內皮細胞損傷，對內皮細胞起保護作用，其機制可能與減少組織DAG的合成、抑制PKC途徑的激活有關。

有氧運動；2型糖尿病；血管性假性血友病因子；纖溶酶原激活物抑制劑；蛋白激酶C

動脈粥樣硬化、冠心病〔1〕等是導致糖尿病(DM)高致殘率和病死率的主要原因，血管病變成為DM最主要的慢性并發癥〔2〕。其中，2型糖尿病(T2DM)發生冠心病的風險是非糖尿病人群的2～4倍〔3〕。由于內皮功能紊亂是DM血管并發癥的始動因素和最重要的病理生理學基礎〔4〕，因此保護血管內皮細胞是防治DM血管并發癥的關鍵。近年研究顯示，有四條病理性通路與糖尿病血管并發癥的發生與發展緊密相關：多元醇途徑；己糖胺途徑；糖基化終末產物(AGEs)形成途徑和蛋白激酶C(PKC)途徑〔5〕。目前，大多數研究都是從AGEs通路去研究藥物對血管的保護機制，尚未見報道從二酯酰甘油(DAG)-PKC信號轉導通路的角度研究長期游泳運動在DM大血管病變發病中的干預作用。本研究擬通過復制T2DM大鼠模型，觀察8 w游泳運動后大鼠血漿中內皮依賴性調節蛋白和胸主動脈組織中DAG-PKC系統的變化，探討其對T2DM大鼠血管內皮細胞的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取8周齡雄性Wistar大鼠，體重200～230 g，購自四川大學華西醫學院動物實驗中心，自由攝食、飲水，室溫22℃～25℃；高糖高脂飼料配方〔6〕：10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鈉，66.5%基礎飼料。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司；酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購自成都三鷹生物技術有限公司；血糖儀購自美國強生公司；高速離心機購自德國Eppendorf公司，超低溫冰箱購自日本Sanyo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DM模型的制備與分組 45只Wistar大鼠適應性喂養1 w，隨機抽取14只分為空白對照組(C組，n=7)和單純運動組(CE組，n=7)，給予普通飼料喂養，其余31只給予高糖高脂喂養7 w后(期間死亡5只)，禁食不禁水12 h給予一次性腹腔注射STZ(溶于0.1 mol/L，pH4.2的枸櫞酸緩沖液中)30 mg/kg，同時C和CE組腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。72 h后用血糖儀檢測非禁食血糖>16.7 mmol/L者作為T2DM大鼠〔7〕，成功20只，隨機分為DM對照組(DM組，n=10)、DM+運動組(DME組，n=10)。

1.2.2 運動方案 采用改進的Ploug等〔8〕游泳訓練方案，池(100 cm×70 cm×60 cm)水深50 cm，水溫(30±2)℃。先進行2次適應性游泳練習，10 min/次。第1周前3 d訓練時間分別為20 min、30 min和45 min，第4天起每天持續游泳60 min，每周運動6 d，共訓練8 w。CE組和DME組進行訓練，C組和DM組不予運動。

1.2.3 觀察指標及檢測方法 實驗期間記錄大鼠一般情況及行為改變，定時稱重。分別于STZ注射前、運動8 w后禁食12 h測量各組大鼠血糖(FBG)、血清胰島素(FINS)。使用血糖儀測定FBG，ELISA測定血清FINS；胰島素抵抗指數HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。運動8 w后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后取下腔靜脈血，EDTA抗凝，4℃，3 000 r/min離心10 min，血漿分裝入1.5 ml EP管，-80℃凍存，用于檢測血漿血管性假性血友病因子(vWF)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)含量，然后迅速開胸腹腔，取出主動脈，做主動脈組織勻漿，檢測主動脈DAG含量以及PKC活性。ELISA測定血漿中vWF、PAI-1和胸主動脈DAG的含量以及PKC活性，測定方法均嚴格按照試劑盒進行。

1.3 統計學方法 應用SPSS16.0統計軟件進行LSD法。

2 結 果

2.1 一般情況 實驗期間由于環境和飲食改變、DM慢性疾病狀態和感染等原因導致大鼠死亡。C組、CE組、DM組、DME組最終進入統計的有效樣本量分別為6、6、7、6只。DM大鼠活動減少，體毛無光澤，多食、多飲、多尿，明顯消瘦。

2.2 各組體重的比較 適應性喂養1 w后，普通飼料喂養大鼠體重(242.00±34.52)g,與高糖高脂飼料喂養大鼠體重(233.30±24.87)g,無顯著差異(P>0.05)。隨著實驗的進行，C組和CE組大鼠體重逐漸增加，DM組和DME組體重逐漸減輕，各組間無明顯差異(P>0.05)。8 w運動后，C組與CE組體重無顯著差異(P>0.05)，DM組體重顯著低于C、CE組(P<0.01)；DME組體重也明顯低于C、CE組(P<0.05)，較DM組增加并不顯著(P>0.05)。見表1。

2.3 各組血糖比較 實驗期間C組和CE組的血糖均為正常水平，且組間無明顯差異(P>0.05)。在STZ注射前、開始運動前及運動后，DM和DME組的血糖水平均明顯高于C組和CE組(P<0.01或P<0.05)。開始運動前，DM組和DME組血糖比較差異無統計學意義(P>0.05)。8 w運動后，DME組的血糖較DM組明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1 各組不同時間點體重的比較±s，g)

與C組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與CE組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

2.4 各組血清FINS和HOMA-IR的比較 實驗期間C組和CE組的血清FINS和HOMA-IR均未有明顯變化，且組間無顯著差異(P>0.05)。STZ注射前，DM組和DME組的血清FINS和HOMA-IR均差異不顯著(P>0.05)，仍明顯高于C組和CE組(P<0.05或P<0.01)。8 w運動后，DM組的血清FINS顯著低于C、CE組(P<0.01)，HOMA-IR顯著高于C、CE組(P<0.01)；與DM組相比，DME組的血清FINS顯著升高(P<0.01)，HOMA-IR水平明顯降低(P<0.05)。見表3。

表2 各組不同時間點血糖的比較

與C組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與CE組比較:3)P<0.05，4)P<0.01；與DM組比較:5)P<0.05，下表同

表3 各組不同時間點FINS及HOMA-IR的比較

2.5 各組血漿vWF和PAI-1的比較 8 w運動后，C組和CE組vWF、PAI-1的水平無明顯差異(P>0.05)。DM組vWF、PAI-1的含量均顯著高于C組和CE組(P<0.01)；與DM組相比，DME組vWF、PAI-1的水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組血漿vWF、PAI-1的比較

2.6 各組胸主動脈中DAG和PKC的比較 8 w運動后，C組和CE組DAG、PKC的水平無明顯差異(P>0.05)；DM組的DAG含量明顯高于CE組(P<0.05)，PKC活性也顯著高于C、CE組(P<0.01)；而DME組的DAG、PKC水平升高不顯著(P>0.05)。DME組與DM組相比，雖然DAG水平差異并不顯著(P>0.05)，但仍表現出了下降的趨勢，同時PKC的活性明顯降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組DAG、PKC的比較

3 討 論

近年來，研究表明，高血糖、高胰島素環境、氧化應激及慢性炎癥等均會導致血管內皮功能發生障礙，血液中的一系列內皮依賴性調節蛋白調控失衡從而產生各種血管并發癥〔9〕。這些內皮調節蛋白主要包括vWF、PAI-1等。研究指出，適宜的有氧運動，能有效改善局部血流動力學，增加神經血流灌注，改善微循環，提高體內抗氧化物質水平，減輕炎癥反應〔10〕。這為有氧運動防治DM并發癥提供了理論依據。

本實驗采用高糖高脂喂養聯合小劑量STZ注射制備T2DM模型，結果發現建立的T2DM大鼠模型是成功的，與國內外學者研究結果一致〔11～13〕。

有資料顯示〔14〕，當血管內皮受損時，內皮細胞中的vWF釋放入血，與凝血因子Ⅷ結合成為載體，促進血小板黏附并聚集于受損的血管內皮下，啟動血栓形成的第一步。因此，血漿中的vWF升高被認為是內皮細胞損傷及功能異常的標志〔15〕。PAI-1是機體纖溶系統的主要生理抑制劑，其濃度增高可引起血液中纖溶作用減弱，纖維蛋白沉積，促進血管基底膜增厚，從而加速動脈粥樣硬化及血栓形成〔16〕。臨床研究表明，T2DM患者血液處于高凝狀態，vWF 水平明顯高于健康成年人〔17〕；而患者血漿PAI-1水平升高造成纖溶活性降低是導致DM高凝狀態的主要因素之一〔18〕。本實驗提示8 w游泳運動能減輕T2DM大鼠內皮細胞損傷，增加抗凝和纖溶能力，延緩血管病變進程，與Montero等〔19〕報道的長期運動訓練可以改善T2DM患者血管內皮功能的結果一致。

本實驗還發現，T2DM大鼠8 w時DAG-PKC通路的確處于慢性激活狀態，這與PKC途徑發病學說是吻合的。PKC通常以無活性形式存在于胞質中，當受到外界刺激時移位至細胞膜而被DAG和鈣激活〔20〕。研究表明，DM患者及動物的多種組織(如主動脈、腎小球、心臟等)中DAG含量增加〔5，21〕，其合成主要來源于從頭合成途徑，即高血糖經酵解產生中間產物，逐步酰化合成DAG〔22〕。細胞內DAG的合成與釋放引起PKC的激活，造成血管基底膜增厚、通透性增加、內皮功能異常等，這是誘發DM多種血管并發癥至關重要的一步〔5，22～24〕。Loganathan等〔25〕研究發現8 w運動干預可以使DM大鼠心肌纖維化程度明顯減輕，同時心肌DAG含量顯著下降，而PKC-βⅡ蛋白表達及活性均無明顯變化，提示長期運動訓練對DM大鼠心臟功能的保護作用與抑制其心肌DAG水平升高有關。Smith等〔26〕也報道，DM大鼠在8 w有氧運動后骨骼肌DAG、FAT/CD36、神經酰胺的水平均顯著下降，從而改善IR。本研究結果表明，8 w游泳運動能通過減少細胞內DAG合成及抑制PKC途徑的激活而減輕T2DM大鼠血管內皮損傷。綜上所述，8 w游泳運動可降低T2DM大鼠FBG水平，改善IR，降低vWF、PAI-1水平，增加抗凝和纖溶能力，減輕DM造成的血管內皮損傷，對內皮細胞起保護作用，其機制可能與減少細胞內DAG的合成、抑制PKC途徑的激活有關。

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〔2015-12-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

蘇全生(1958-)，男，教授，主要從事運動性疲勞的機制與恢復研究。

黃玫梅(1985-)，女，碩士，助教，主要從事運動干預與健康促進研究。

R363

A

1005-9202(2017)08-1849-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.012

1 成都體育學院運動醫學與健康學院 2 井岡山大學體育學院