淫羊藿苷對氧糖剝奪PC12細胞單胺類遞質含量的影響

莫鎮濤 李文娜 翟玉榮 石京山 龔其海

(遵義醫學院珠海校區藥理教研室，廣東 珠海 519041)

淫羊藿苷對氧糖剝奪PC12細胞單胺類遞質含量的影響

莫鎮濤 李文娜 翟玉榮 石京山1龔其海1

(遵義醫學院珠海校區藥理教研室，廣東 珠海 519041)

目的 研究淫羊藿苷對氧糖剝奪PC12細胞單胺類遞質紊亂的調節作用。方法 采用PC12細胞氧糖剝奪(2 h)損傷模型，將10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷預給藥1 h加氧糖剝奪期間給藥2 h后，用MTT法檢測細胞活力，ELISA法檢測細胞上清液的去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)含量。結果 10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷均能顯著升高氧糖剝奪PC12細胞上清液的NE、DA、5-HT含量和細胞的活力(P<0.05)。結論 淫羊藿苷保護氧糖剝奪PC12細胞的作用可能與調節單胺類遞質紊亂有關。

淫羊藿苷；PC12細胞；去甲腎上腺素；多巴胺；5-羥色胺

淫羊藿為小檗科淫羊藿Epimedium L植物，具有“溫腎壯陽，強筋骨，祛風濕”的功效，常用于治療陽痿，筋骨痿軟，風濕痹痛，拘攣麻木，半身不遂等證。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分之一。近年研究表明，淫羊藿苷對腦缺血性損傷具有顯著的治療作用〔1～3〕，但具體作用機制尚不完善。單胺類遞質紊亂參與了腦缺血性損傷過程，因此本課題單胺類遞質的角度出發，觀察淫羊藿苷對去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 PC12細胞為崔國禎博士惠贈；DMEM高糖培養液、胎牛血清、馬血清、0.25%胰酶均為Gibco公司產品；細胞培養板為 Corning公司產品；噻唑藍(MTT)、DMSO生物工程(上海)股份有限公司，批號：0914B50、批號：0929SJB；大鼠NE(批號：BI140724123)、大鼠DA(批號：BI140722023)及5-HT ELISA試劑盒(批號:BI140723059)均為廣州市佰而林生物科技有限公司公司產品；尼莫地平注射液為德國拜耳公司產品，批號：BXa2EV1；淫羊藿苷為南京澤朗醫藥科技有限公司產品，純度HPLC檢測為98.3%，淫羊藿苷用DMSO配成10-3mol/L溶液于-20℃儲存備用，用時用Earle平衡鹽溶液和細胞完全培養液分別配制成10-7、10-6、10-5mol/L藥液；Earle平衡鹽溶液配制：各藥品濃度為116 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.8 mmol/L MgSO4，1 mmol/L NaH2PO4，0.9 mml/L CaCl2和10 mg/L酚紅；細胞完全培養液：5%胎牛血清+5%馬血清+90% DMEM高糖培養液。

1.2 主要儀器設備 CO2培養箱(HF90)、三氣培養箱(力康生物醫療科技控股有限公司，HF100)；臺式冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司，KDC-140HR)、恒溫箱(上海一恒科學儀器有限公司，DHP-9012)、酶標儀(美國Themo scientific公司，Multiskan Mk3)；萬分之一天平(德國賽多利斯公司，BSA124S)。

1.3 方法

1.3.1 造模 PC12細胞經復蘇后，用含5%的胎牛血清和5%的馬血清的高糖DMEM培養液3～5 ml接種于25 cm2培養瓶并放置于37℃，5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養。當細胞長滿單層后，用0.25%胰酶消化，調成細胞濃度為1×105個/ml，每孔100 μl接種于96孔板；5×105個/ml，每孔1 ml接種于6孔板中。實驗分成6組，正常組和模型組加入完全培養基，陽性對照組加入含10 μmol/L 尼莫地平的完全培養基培養1 h，淫羊藿苷低、中、高劑量組分別加入含10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷的完全培養基培養1 h，除正常組外，其余各組吸棄含藥完全培養基，模型組加入Earle平衡鹽溶液，陽性對照組加入含10 μmol/L 尼莫地平的Earle平衡鹽溶液，淫羊藿苷高、中、低劑量組分別加10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷的Earle平衡鹽溶液，并放入通有1%O2，5%CO2和94%N2的37℃培養箱中培養2 h后，96孔板培養的細胞用于MTT檢測，6孔板培養的細胞，取其細胞培養上清液(即氧糖剝奪后的Earle平衡鹽溶液)用于ELISA檢測。

1.3.2 MTT檢測 每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT的完全培養液，放置于37℃，5% CO2的培養箱中再培養4 h后，吸棄細胞培養液，每孔加入150 μl的DMSO,置微量振蕩器上振蕩10 min，酶標儀測定波長為570 nm的OD值。

1.3.3 ELISA檢測 每孔取100 μl細胞培養上清液用于檢測NE、DA、5-HT。檢測方法按照說明書進行，最后在450 nm測定其OD值。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件，組間比較進行t檢驗。

2 結 果

2.1 淫羊藿苷對氧糖剝奪PC12細胞活力的影響 與正常組比較，造模后細胞活力顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各劑量淫羊藿苷均能顯著提高氧糖剝奪PC12細胞的細胞活力(P均<0.01)，見表1。

2.2 淫羊藿苷對氧糖剝奪PC12細胞NE的影響 與正常組比較，造模后細胞上清液NE、DA及5-HT含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各劑量淫羊藿苷均能顯著提高細胞上清液NE、DA及5-HT含量(P<0.05，P<0.01)，見表1。

2.3 淫羊藿苷對氧糖剝奪PC12細胞DA的影響 與正常組比較，造模后細胞上清液DA含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各劑量淫羊藿苷均能顯著提高細胞上清液DA含量(P<0.05，P<0.01)，見表1。

表1 淫羊藿苷對PC12細胞活力、細胞上清液NE、DA及5-HT含量的影響

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

2.4 淫羊藿苷對氧糖剝奪PC12細胞5-HT的影響 與正常組比較，造模后細胞上清液5-HT含量顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，各劑量淫羊藿苷均能顯著提高細胞上清液5-HT含量(P<0.05，P<0.01)，見表1。

3 討 論

NE、DA、5-HT是中樞神經系統重要的單胺類遞質，在維持大腦正常的生理功能方面起著重要作用。腦內NE具有調節體溫、注意力、意識、警覺、睡眠-覺醒、焦慮和疼痛、學習和記憶、情緒、內分泌、心血管系統功能等〔4〕。腦內DA具有調節軀體活動、行為、意志、認知與情感、睡眠-覺醒、內分泌的作用〔5〕。腦內5-HT具有調節認知能力、意志、行為、焦慮和疼痛、精神情緒、聽覺、內分泌、體溫、睡眠等功能〔6〕。

NE、DA、5-HT等單胺類神經遞質參與了腦缺血損傷過程，但這些單胺類遞質在腦缺血中的作用，目前的研究結果存在分歧〔7〕。持“單胺類神經遞質損傷作用”觀點的學者認為，NE、5-HT等通過發揮血管活性作用，使血管收縮，加重了腦血水和腦水腫〔8〕，促使神經元內鈣超載，介導神經元壞死〔9〕。DA通過介導興奮性氨基酸作用，代謝后生成自由基等產生細胞毒性作用〔10,11〕。持“單胺類神經遞質保護作用”觀點的學者觀察到，損害腎上腺素的中樞核團藍斑時可加重缺血性腦損傷〔12〕；增加NE釋放的藥物能明顯抑制腦缺血后海馬及新皮層神經元壞死，而抑制NE生成的藥物則使海馬和紋狀體神經元損傷顯著加劇〔13〕。5-HT1A 受體激動劑能使細胞膜超極化，對抗缺血引起的神經元內Ca2+超載〔14〕。

PC12細胞是一種來自大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤的克隆細胞系。加入神經生長因子(培養基中加入的胎牛血清，具有神經生長因子)后，PC12細胞分化為交感神經元樣細胞，呈現神經元樣的形態和功能〔15〕。因其具可傳代培養的特點，已被廣泛用于神經藥理學的研究〔16,17〕。因此本課題采用PC12細胞作為體外缺血性腦損傷的研究材料。

尼莫地平注射液是鈣離子通道的拮抗藥，常用于治療缺血性腦損傷，臨床療效顯著，所以采用尼莫地平作為陽性對照藥。本實驗結果顯示,10-7、10-6、10-5mol/L淫羊藿苷對NE、DA、5-HT作用的量效關系不明顯，原因可能是這三個濃度的藥物對細胞的細胞活力差別不大，所以對這些指標的量效關系不明顯。本研究結果顯示，正常PC12細胞的上清液有一定的NE、DA、5-HT含量，它們在維持細胞的正常生理功能起著重要的作用。PC12細胞氧糖剝奪后，細胞上清液的NE、DA、5-HT含量顯著下降，原因可能是氧糖剝奪后細胞能量代謝障礙〔18〕，單胺類遞質的合成和釋放受到抑制。而淫羊藿苷和尼莫地平給藥后，氧糖剝奪PC12細胞的NE、DA、5-HT的含量與模型組比較，顯著升高，表明淫羊藿苷可能通過減輕鈣離子超載，減輕細胞損傷，進而顯著恢復NE、DA、5-HT的合成和釋放作用。

1 Hu HQ,Zhou YH,Cao BZ,etal.Inhibitory effect of icariin on expression of myclin inhibitory factors in the central nervous system of rats with focal cerebral ischemia〔J〕.Neural Regen Res,2010;5(16):1211-5.

2 Zhu HR,Wang ZY,Zhu XL,etal.Icariin protects against brain injury by enhancing SIRT1-dependent PGC-1alpha expression in experimental stroke〔J〕.Neuropharmacology,2010;59(1-2):70-6.

3 馬 立，吳明華，韓 漾，等.淫羊藿苷對急性大腦中動脈梗死大鼠SDF-1及其受體CXCR-4的影響〔J〕.中國中醫急癥，2014;23(5):821-2.

4 王 丹.下丘腦室旁核內的去甲腎上腺素在壓力感受性反射調節中的作用及其機制探討〔D〕.延吉：延邊大學，2013.

5 張國炳，陳峻嚴.腦內多巴胺受體的分布和功能〔J〕.中國校醫，2013;27(1)：38-9.

6 袁偉杰，陳峻嚴.腦內5-羥色胺受體的分布和功能〔J〕.國際神經病學神經外科學雜志，2011;38(6)：564-6.

7 何 治，袁 丁，姚 嵐.單胺類神經遞質與腦缺血關系研究進展〔J〕.江蘇醫藥,2011；37(10)：1186-8.

8 Kiray M,Bagriyanik HA,Pekcetin C,etal.Protective effects of deprenyl in transient cerebral ischemia in rats〔J〕.Chin J Physiol,2008;51(5):275-81.

9 Wang Y,Chang CF,Morales M,etal.Diadenosine tetraphosphate protects against injuries induced by ischemia and 6-hydroxy dopamine in rat brain〔J〕.J Neurosci,2003;23(21):7958-65.

10 Surmeier DJ,Ding J,Day M,etal.D1 and D2 dopamine receptor modulation of striatal glutamatergic signaling in striatal medium spiny neurons〔J〕.Trends Neurosci,2007;30(5):228-35.

11 Seif-El-Nasr M,Atia AS,Abdelsalam RM.Effect of MAO-B inhibition against ischemia-induced oxidative stress in the rat brain.Comparison with a rational antioxidant〔J〕.Arzneimittelforschung,2008;58(4):160-7.

12 Debeir T,Marien M,Ferrario J,etal.In vivo upregulation of endogenous NGF in the rat brain by the alpha2-adrenoreceptor antagonist dexefaroxan:potential role in the protection of the basalocortical cholinergic system during neurodegeneration〔J〕.Exp Neurol,2004;190(2):384-95.

13 Muralikrishna Adibhatla R,Hatcher JF.Phospholipase A2,reactive oxygen species and lipid peroxidation in cerebral ischemia〔J〕.Free Radic Biol Med,2006;40(3):376-87.

14 Gavrilov SS,Kulinski VI.5-hydroxytryptamine and 5-methoxytryptamine increase tolerance to global cerebral ischemia〔J〕.Eksp Klin Farmakol,2007;70(6):17-8.

15 Greene LA,Tischler AS.Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,1976;73(7):2424-8.

16 王占強，賈春紅，魯 楊，等.二氮嗪對氧糖剝奪后PC12細胞凋亡及對Bcl-2蛋白的影響〔J〕.中國藥理學通報，2010;26(7):930-3.

17 李延紅，周占業，史 齊，等.低濃度亞硝酸鈉預處理對乙醇損傷PC12細胞的保護作用〔J〕.中國藥理學通報，2011;27(7):952-7.

18 Mo ZT,Fang YQ,He YP,etal.Changes of beclin-1 dependent on ATP,〔Ca2+〕i and MMP in PC12 cells following ischemia-reperfusion injury〔J〕.Cell Biol Int,2012;36(11):1043-8.

〔2016-01-06修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

教育部新世紀優秀人才支持計劃(NCET-11-0927)；貴州省聯合基金重點項目(黔科合J字LKZ〔2013〕04號)；遵義醫學院博士啟動基金(F-590)；珠海市優勢學科建設項目(2015年)

龔其海(1975-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事神經藥理學研究。

莫鎮濤(1983-)，男，博士，副教授，主要從事中醫藥治療腦病機制研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)08-1852-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.013

1 遵義醫學院基礎藥理省部共建教育部重點實驗室