二苯乙烯苷對血管性癡呆大鼠室管膜細胞增殖的影響

馬海涵 邵志成 陳力學 邵 陽

(解放軍第153中心醫院神經內科，河南 鄭州 450042)

二苯乙烯苷對血管性癡呆大鼠室管膜細胞增殖的影響

馬海涵 邵志成1陳力學1邵 陽2

(解放軍第153中心醫院神經內科，河南 鄭州 450042)

目的 探討二苯乙烯苷(TSG)對血管性癡呆(VD)大鼠海馬血流量和腦室管膜細胞變化的影響。方法 實驗分為假手術組、模型組、TSG組，后兩組采用4血管阻斷法(4-VO法) 建立VD大鼠模型。假手術組麻醉及手術過程與模型組相同，但不電凝雙側椎動脈，不阻斷雙側頸總動脈。水迷宮法評價行為學。應用氫清除法檢測大鼠海馬血流量。用5-溴脫氧尿核苷(BrdU)免疫熒光染色，顯微鏡下觀察室管膜下區(SVZ)干細胞增殖。結果 與假手術組比較，模型組大鼠學習與記憶能力下降，表現為游全程時間延長，錯誤次數增加(P<0.01)。手術后7 d，與模型組比較，TSG組海馬血流量明顯提高和腦室管膜BrdU免疫熒光染色陽性細胞明顯增加(P<0.01)。結論 TSG可改善VD大鼠海馬血流量和促進腦室管膜細胞增殖。

二苯乙烯苷；血管性癡呆；海馬血流量；腦室管膜細胞

研究證實成體動物腦室管膜下區(SVZ)和海馬齒狀回(SGZ)神經前體細胞可以再生，腦缺血后可以激活SVZ區細胞的增殖，但腦缺血后腦內微環境不太適于增殖細胞的存活以及向神經元方向分化。改善腦內微環境如血流動力學變化等因素，可能有利于SVZ區細胞增殖和分化〔1〕。二苯乙烯苷(TSG)是何首烏的主要成分之一，能夠抑制生物膜脂質的過氧化，提高機體超氧化物歧化酶(SOD)的活性〔2,3〕。但TSG能否改善腦組織血流量和促進SVZ區細胞增殖報道較少。本研究觀察TSG對血管性癡呆(VD)模型大鼠學習記憶、腦組織血流量和SVZ區細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、動物及分組 TSG(本室自制，HPLC測定純度為90%)。健康SD大鼠30只，3～4月齡，雄性，體重200～250 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。實驗分為假手術組、模型組、TSG組。TSG組灌胃TSG 60 mg·kg-1·d-1，5 d/w，連續4 w，假手術組與模型組均灌胃等容量生理鹽水；造模共6 w后，開始測定。

1.2 模型的建立 采用大鼠四血管阻斷法(4-VO法)制成血管性癡呆大鼠模型：將大鼠用10% 的水合氯醛(35 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術臺上；常規消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈。用4號絲線結扎。拉緊絲線，同時在距尾尖1 cm處剪斷放血約0.3 ml，熱凝止血。阻斷血流20 min，松開絲扣再灌注10 min后，再次阻斷血流20 min，第2次再灌后觀察30 min，縫合皮膚，切口局部注射慶大霉素0.2萬U。假手術組只分離頸總動脈，穿線但不結扎，尾部不放血。

1.3 行為學檢測 采用Morris水迷宮法進行大鼠記憶功能的測定。Morris水迷宮由中國醫學科學院生產，為一不銹鋼的圓形水池，直徑150 cm，高50 cm。池壁標明4個入水點，由此將水池等分為4個象限，任選其中1個象限，正中放置1個直徑14 cm、高29 cm的平臺。測試程序為定位航行試驗：歷時5 d，每天上、下午各2次，將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中，記錄其在3 min內尋找到并爬上平臺的時間即逃避潛伏期。分別在術后4、8 w重新進行水迷宮實驗，大鼠每次在3 min內尋找到并爬上平臺的時間為大鼠的記憶成績，2次/d，連續5 d，計算平均成績。

1.4 腦組織血流量測定〔4〕按照大鼠腦立體定位圖譜，應用氫清除法的測定：應用氫清除法檢測大鼠海馬血流量。記錄電極插入矢狀縫旁開2 mm、深3.5 mm、前囟向后2.8 mm處，參考電極放于皮下顳肌旁，大鼠以呼吸機輔助呼吸(70次/min，潮氣量2 ml)，待描筆穩定后經氣管插管吸入10 %的氫氣1 min，記錄完整的清除曲線。根據公式計算皮層局部血流量。

1.5 BrdU標記法 各組大鼠于處死前兩天按100 mg/kg 腹腔注射BrdU生理鹽水液(Sigma公司提供),每日2 次。BrdU免疫熒光染色麻醉動物。4%多聚甲醛400 ml經左心室灌注后，斷頭取腦，置4%多聚甲醛后固定24 h，冠狀位切取以缺血區域為中心的包括側腦室室管膜下區的腦組織標本，冰凍切片，片厚5 μm，進行BrdU免疫熒光染色，顯微鏡下觀察SVZ區干細胞增殖情況。并在200倍鏡下，每只大鼠選5張切片，每張切片取4個視野(單位面積) 計數SVZ區缺血側和缺血對側的BrdU陽性細胞數。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠行為學變化 與假手術組比較，模型組的游全程時間逐漸延長，錯誤次數逐漸增加(均P<0.01)。與模型組比較，TSG組學習成績和記憶成績均有顯著提高(均P<0.01)，表明TSG有提高學習記憶能力的作用，見表1。

表1 TSG對VD模型大鼠水迷宮學習成績影響

與模型組比較:1)P<0.05

2.2 海馬血流量的變化 模型制作后7 d，與假手術組〔(48.5±7.2)ml·min-1·100 g-1〕比較，模型組〔(25.5±3.7)ml·min-1·100 g-1〕和TSG組〔(33.45±3.35)ml·min-1·100 g-1〕海馬血流量明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，TSG組海馬血流量明顯升高(P<0.01)，表明TSG有提高海馬血流量的作用。

2.3 SVZ區BrdU陽性細胞數的變化 見表2。與假手術組比較，模型組和TSG組模型雙側SVZ區均可見BrdU陽性細胞，

表2 TSG對VD模型大鼠SVZ區細胞增殖的 作用,個/點,n=10)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

主要分布在側腦室背外側角和外側壁。假手術組的BrdU陽性細胞數量少，呈散在分布；模型組和TSG組模型大鼠在手術后3 d，BrdU陽性細胞明顯增多，7 d時達到峰值，之后逐漸減少。與模型組比較，TSG組BrdU陽性細胞明顯升高(P<0.01)，表明TSG有促進SVZ區細胞增殖的作用。

3 討 論

由于腦組織反復缺血，導致海馬、基底神經結及皮層等結構產生不可逆性損傷，隨之出現癡呆癥狀〔5,6〕。研究顯示氧化損傷是導致VD的重要病理因素，腦缺血發生后，缺血缺氧的腦組織通過黃嘌呤氧化酶系統、花生四烯酸-環氧酶系統及線粒體等途徑產生大量自由基，由于腦組織生物膜中含有大量的多聚不飽和脂肪酸，因此腦對自由基損害尤為敏感〔7〕。因此自由基的毒性作用已被認為腦缺血損害導致VD的關鍵性病理環節之一。研究表明，TSG能夠抑制生物膜脂質的過氧化，提高機體SOD的活性，從而抑制機體氧應激狀態的產生，對VD模型大鼠在學習和記憶能力等行為學以及自由基代謝的產生影響〔3，4，8，9〕。本研究表明TSG能夠促進海馬組織微循環，提高再灌注，促進SVZ區細胞增殖，改善VD大鼠學習與記憶能力。

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4 Li RP,Wang ZZ,Sun MX,etal.Polydatin protects learning and memory impairments in a rat model of vascular dementia〔J〕.Phytomedicine,2012;19(8-9):677-81.

5 Zimny A,Leszek J,Kiejna A,etal.Analysis of correlation between the degree of cognitive impairment and the results of perfusion CT in patients with dementia〔J〕.Med Sci Monit,2007;13(1):23-30.

6 Tang Z,Pi X,Chen F,etal.Fifty percent reduced-dose cerebral CT perfusion imaging of Alzheimer′s disease:regional blood flow abnormalities〔J〕.Am J Alzheimers Dis Other Dement,2012;27(4):267-74.

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〔2015-05-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

四川省杰出青年學科帶頭人培養基金資助(05ZQ026-020)；四川省科技攻關項目資助(05SG1866)

邵 陽(1968-),男,博士,教授,主要從事神經疾病發病機制研究。

馬海涵(1972-)，博士，副主任醫師，主要從事腦血管病研究。

R255.2

A

1005-9202(2017)08-1862-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.017

1 重慶醫科大學第一附屬醫院 重慶市神經病學重點實驗室 2 南京醫科大學第二附屬醫院神經內科