七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制

王建偉 李 佳 曹利艷 米 琰 劉曉飛 張 馳 孫偉鵬

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450008)

七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制

王建偉 李 佳 曹利艷 米 琰 劉曉飛 張 馳1孫偉鵬1

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州 450008)

目的 探討七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制。方法 將64只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、七氟烷組(S組)、咪達(dá)唑侖組(M組)、七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖組(S+M組)，每組大鼠16只，處理后采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠認(rèn)知功能的變化以及各組大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體(NR)1、NR2B mRNA表達(dá)情況、各組大鼠海馬神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白表達(dá)。結(jié)果 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練1 d，各組大鼠潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，訓(xùn)練3 d、5 d，各麻醉組大鼠潛伏期均顯著高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且S+M組大鼠潛伏期明顯高于S組及M組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；將平臺(tái)撤除后，各麻醉組大鼠60 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且S+M組大鼠穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯低于S組及M組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組大鼠海馬NR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，S組與S+M組大鼠海馬NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量較C組、M組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，M組與C組大鼠海馬NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與C組比較，各麻醉組大鼠海馬nNOS蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且S+M組大鼠海馬nNOS蛋白表達(dá)量最低，而各組大鼠海馬caspase-3蛋白表達(dá)情況無(wú)明顯變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖可引起大鼠認(rèn)知功能的降低，其機(jī)制可能與抑制NR2B、NOS表達(dá)有關(guān)，而與神經(jīng)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯關(guān)系。

七氟烷；咪達(dá)唑侖；認(rèn)知功能

老年患者術(shù)后更易出現(xiàn)人格的改變、記憶力的降低、情緒異常及精神錯(cuò)亂等相關(guān)表現(xiàn)〔1,2〕。而這種術(shù)后所出現(xiàn)的一系列變化成為術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)〔3〕。七氟烷作為一種吸入性麻醉藥物，其誘導(dǎo)和蘇醒期平穩(wěn)，具有較強(qiáng)的麻醉效力，且對(duì)患者肝腎功能的影響較小，是目前臨床上廣泛使用的一種麻醉藥物〔4〕。本研究探討七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取12月齡健康SD大鼠64只，雄性，體質(zhì)量550～600 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 吸入用七氟烷(上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，H20070172)、咪達(dá)唑侖(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，H20031037)、RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)、RT-PCR試劑盒(加拿大MBI Fermentas公司)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京天德悅生物科技有限責(zé)任公司)、Caspase-3 抗體(Abcam)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)抗體(Abcam)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)、引物合成有北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。Morris恒溫水迷宮(張家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠)、DY-89 Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 造模方法及分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組(C組)、七氟烷組(S組)、咪達(dá)唑侖組(M組)、七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖組(S+M組)，每組各16只，動(dòng)物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，讓其自由取食飲水，溫度22℃，濕度60%～80%。S組、S+M組置于自制的有機(jī)玻璃麻醉箱內(nèi)進(jìn)行麻醉，對(duì)大鼠進(jìn)行七氟烷吸入麻醉，箱內(nèi)七氟烷濃度為3.0%，麻醉時(shí)間為2 h。C組與M組自由呼吸空氣，M組腹腔注射5 mg/kg咪達(dá)唑侖，待S+M組從麻醉箱內(nèi)取出后腹腔注射5 mg/kg咪達(dá)唑侖，C組及S組則給予等體積生理鹽水腹腔注射。待各組恢復(fù)清醒后放置會(huì)動(dòng)物房常規(guī)飼養(yǎng)，麻醉處理后的24 h各組隨機(jī)抽取8只斷頭處死，在無(wú)菌錫箔紙覆蓋的冰袋上分離大鼠海馬，然后置于液氮中24 h，再轉(zhuǎn)至-80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩８鹘M剩余大鼠則于麻醉后24 h開(kāi)始進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮是一個(gè)直徑120 cm、水深50 cm的圓形鐵皮水池。池壁上分布東、南、西、北四個(gè)入水點(diǎn)，水池的南北、東西連線將水池分為4個(gè)象限，在第4象限正中池壁處放置與水池背景同色的平臺(tái)，水面較平臺(tái)高出3 cm。在水中放入脫脂奶粉，使水變渾濁，以隱藏水下的平臺(tái)，水溫控制在(24±1)℃。同時(shí)為了視頻追蹤的需要，在水迷宮中央正上方2 m處放置一臺(tái)攝像機(jī)，以記錄動(dòng)物在水池中的位置、運(yùn)行的速度以及運(yùn)動(dòng)的軌跡。定位航行實(shí)驗(yàn)：從任一象限開(kāi)始，將大鼠按照順時(shí)針?lè)较蛞来畏湃?個(gè)象限，記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間即為潛伏期，若大鼠在60 s內(nèi)仍未找到平臺(tái)，則將大鼠直接引導(dǎo)至平臺(tái)上，并讓大鼠在平臺(tái)上適應(yīng)性停留10 s，且此次實(shí)驗(yàn)潛伏期計(jì)為60 s。定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，取每日平均值作為大鼠潛伏期成績(jī)。空間探索實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)第6天撤去平臺(tái)，記錄大鼠在60 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù)。

1.5 RT-PCT檢測(cè)大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)受體NR1、NR2B mRNA表達(dá) 各組大鼠分離后的海馬組織采用RT-PCR法檢測(cè)NR1、NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量。采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)如下：NR1(328 bp)上游5'-TCGGTATCAGGAATGCG-3'，下游5'-GGTGCTCGTGTCTTTGG-3'；NR2B(381 bp)上游5'-GCTCAGCGACCTGTATGG-3'，下游5'-TCGTCACTGCGTTCTTTGT-3'；β-actin(448 bp)上游5'-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3'。RNA提取參照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為NR1：94℃ 45 s、53℃ 45 s、72℃ 45 s，共34個(gè)循環(huán)；NR2B：94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃ 45 s，共34個(gè)循環(huán)；β-actin：94℃ 45 s、54℃ 45 s、72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀下觀察電泳結(jié)果，采用Image J分析軟件處理圖像，以目標(biāo)基因條帶綜合光密度與β-actin條帶光密度之間的比值作為目標(biāo)基因的相對(duì)含量。

1.6 Western印跡檢測(cè)大鼠海馬nNOS、caspase-3蛋白表達(dá) 分離后的海馬組織內(nèi)加入蛋白提取試劑，4℃條件下離心15 min(12 000 r/min)，并按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。配制8%/10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，再將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉粉筆1 h后加入一抗(分別為1∶2 000稀釋的nNOS與1∶4 000稀釋的Caspase-3抗體)，4℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光，曝光。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期比較 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練1 d，各組潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，訓(xùn)練3 d、5 d，各麻醉組潛伏期均顯著高于C組(P<0.05)，且S+M組大鼠潛伏期明顯高于S組及M組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期比較

與C組比較：1)P<0.05；與S組比較:2)P<0.05；與M組比較:3)P<0.05，下表同

2.2 各組Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)60 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)的次數(shù) 將平臺(tái)撤除后，S組、M組及S+M組麻醉組60 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)分別為(3.73±1.25)、(4.16±1.09)、(2.36±0.85)次，均明顯低于C組(P<0.05)，且S+M組大鼠穿過(guò)平臺(tái)次數(shù)明顯低于S組及M組(P<0.05)。

2.3 各組大鼠海馬NR1、NR2B mRNA表達(dá)情況 各組海馬NR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，S組與S+M組海馬NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量較C組、M組顯著降低(P<0.05)，M組與C組大鼠海馬NR2B mRNA相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 各組海馬nNOS、caspase-3蛋白表達(dá)情況 與C組比較，各麻醉組海馬nNOS蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且S+M組海馬nNOS蛋白表達(dá)量最低，而各組大鼠海馬caspase-3蛋白表達(dá)情況無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

表2 各組大鼠海馬NR1、NR2B mRNA 相對(duì)表達(dá)量

圖1 各組大鼠海馬nNOS、caspase-3蛋白表達(dá)

3 討 論

研究證明〔5，6〕，全身麻醉后大腦發(fā)生了基因表達(dá)改變、神經(jīng)元凋亡等廣泛而持久的變化，短時(shí)間的單純麻醉即可造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間的認(rèn)知功能障礙，臨床上則主要表現(xiàn)為POCD，其中以老年患者尤為多見(jiàn)。相關(guān)調(diào)查顯示〔7〕，10%～14%的老年患者，經(jīng)全身麻醉手術(shù)后可發(fā)生長(zhǎng)期的認(rèn)知功能障礙。七氟烷吸入麻醉是否能引起患者POCD，目前尚無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，左蕾等〔8〕認(rèn)為七氟烷對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響具有一定的劑量依賴性，濃度越高則對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響更為嚴(yán)重。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)作為研究空間學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，不僅能夠反映動(dòng)物的空間認(rèn)知，同時(shí)還能夠有效評(píng)價(jià)藥物干預(yù)后對(duì)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的變化〔9〕。本研究表明七氟烷或咪達(dá)唑侖麻醉均對(duì)老年大鼠的認(rèn)知功能具有一定的影響，其中七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響更嚴(yán)重。

NR1是NMDAR受體復(fù)合物的功能性亞單位，而NMDAR介導(dǎo)一系列高級(jí)的神經(jīng)活動(dòng)，是構(gòu)成中樞神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)記憶功能的重要基礎(chǔ)，NR1含量可代表NMDA的總量〔10〕。NR2B則是NMDAR調(diào)節(jié)亞單位，NR2B水平可反映NR受體功能的變化情況〔11〕。本研究表明七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖降低海馬區(qū)NR2B mRNA的表達(dá)，提示NR2B表達(dá)降低可能與大鼠認(rèn)知功能降低之間具有密切的聯(lián)系，這與以往的報(bào)道結(jié)果相一致〔12〕。

一氧化氮(NO)作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元之間起著信息傳遞的作用，尤其在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程當(dāng)中發(fā)揮著重要作用〔13〕。由于NO具有不穩(wěn)定性，目前一般多為一氧化氮合酶(NOS)表示機(jī)體內(nèi)NO活性，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)〔14〕，老年大鼠記憶減退與其海馬區(qū)NOS表達(dá)降低有關(guān)。本研究結(jié)果表明七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖對(duì)鼠認(rèn)知功能的影響可能與抑制機(jī)體NO活性有關(guān)。目前一般認(rèn)為細(xì)胞凋亡是一系列高度調(diào)控的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的結(jié)果，其中caspase-3可有效反映細(xì)胞凋亡情況〔15〕，本研究表明七氟烷復(fù)合咪達(dá)唑侖麻醉對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞的凋亡影響不大。

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〔2016-12-35修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)

河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)計(jì)劃(No.122300410408)

王建偉(1973-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事疼痛學(xué)研究。

R6

A

1005-9202(2017)08-1864-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.018

1 鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院