雙氫青蒿素對肺癌細胞增殖的抑制作用

周國運 王 熙 曹干生 宋 燁

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院綜合藥學(xué)部，湖北 武漢 430014)

雙氫青蒿素對肺癌細胞增殖的抑制作用

周國運 王 熙1曹干生 宋 燁

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院綜合藥學(xué)部，湖北 武漢 430014)

目的 探討雙氫青蒿素對肺癌細胞生長增殖的抑制作用。方法 用MTT法觀察濃度為4、8、16、32、64、128、256 μmol/L的雙氫青蒿素對三種不同的肺癌細胞SPC-A-1、Calua-3、PC-14作用48 h的增殖抑制作用，同樣用MTT檢測29 μmol/L的雙氫青蒿素作用時間為12、24、48、72、96 h后的肺癌細胞增殖情況，經(jīng)DNA ladder和流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。結(jié)果 雙氫青蒿素對三種肺癌細胞的抑制率從大到小依次為：SPC-A-1、PC-14、Calua-3。肺癌細胞SPC-A-1在雙氫青蒿素的作用下細胞抑制率較PC-14、Calua-3肺癌細胞大，利用軟件計算出細胞SPC-A-1、PC-14、Calua-3的IC50分別為28.9、46.9、78.6 μmol/L。雙氫青蒿素作用時間為12、24、48、72和96 h的細胞抑制率較0 h差異顯著(P<0.01)。說明隨著作用時間的加長，抑制增殖效果越強。29 μmol/L的雙氫青蒿素作用48 h后的肺癌細胞出現(xiàn)明顯的類似梯子樣條帶，說明雙氫青蒿素可以促進肺癌細胞的增殖。流式細胞儀結(jié)果表明，經(jīng)藥物作用后的SPC-A-1細胞的凋亡率較對照組顯著增高(P<0.01)，這表明雙氫青蒿素抑制肺癌細胞SPC-A-1的增殖主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡所引起的。結(jié)論 雙氫青蒿素可通過誘導(dǎo)細胞凋亡抑制肺癌細胞增殖分化。

雙氫青蒿素；肺癌細胞；凋亡；增殖

傳統(tǒng)的治療肺癌的方法主要有手術(shù)治療和化療，療效有限，而且手術(shù)治療對患者身體狀況要求較高，化療會損害人體正常的組織細胞〔1〕。青蒿素是從菊科蒿屬黃花蒿莖葉中提取的一種內(nèi)酯類〔2〕。有研究表明，中藥青蒿素除了具有抗瘧等作用外，還具有抗腫瘤的作用，相比于傳統(tǒng)的化療，副作用小，安全性高。雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物之一，在青蒿素的衍生物中活性較強〔3〕。已經(jīng)有研究表明，雙氫青蒿素可以抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等癌癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究選用3種不同的肺癌細胞系SPC-A-1、Calua-3、PC-14，通過噻唑藍(MTT)法選出最為敏感細胞系，經(jīng)DNA ladder瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞儀檢測雙氫青蒿素與肺癌細胞凋亡作用的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人肺癌細胞系SPC-A-1、Calua-3、PC-14購于上海生化所細胞庫。主要儀器及試劑：水浴鍋：長沙基隆儀器儀表有限公司，超凈工作臺：蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司，酶標儀：賽飛(中國)有限公司，倒置顯微鏡：日本尼康，流式細胞儀：杭州聯(lián)科生物科技有限公司，離心機：鹽城市凱特實驗儀器有限公司，青鏈霉素、RPMI1640、胰蛋白酶：美國Sigma，PBS：鼎國生物試劑有限公司，胎牛血清(FBS)：上海易利生物科技有限公司，雙氫青蒿素：山東新華制藥有限公司，碘化丙啶(PI)：鼎國生物試劑有限公司，膜聯(lián)蛋白(Annexin)V：鼎國生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖抑制作用 肺癌細胞用含10%FBS的PRMI-1640細胞生長液培養(yǎng)，放置于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化液對細胞進行消化并傳代。

1.2.1.1 雙氫青蒿素濃度對肺癌細胞生長影響 根據(jù)細胞不同，將細胞分為3組，觀察1組細胞為SPC-A-1；觀察2組細胞為Calua-3；觀察3組細胞為PC-14。取含有胰蛋白酶含量為0.25%的消化液消化3組對數(shù)生長期的單層肺癌細胞，用10%FBS的RPMI 1640細胞生長液懸浮細胞，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞濃度為每孔6×103個，每孔加入細胞生長液100 μl，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的雙氫青蒿素，濃度分別為4、8、16、32、64、128、256 μmol/L，每組樣品設(shè)置5個復(fù)孔，并設(shè)立陰性對照組，在陰性組中加入等量的二甲基亞砜(DMSO)代替雙氫青蒿素，在空白組中加等量藥物但不加細胞，放置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)48 h后，加入體積20 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4 h，小心倒掉上清，在沉淀中加入150 μl的DMSO，持續(xù)10 min，觀察結(jié)晶物充分溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為490 nm處檢測每個孔的光吸收值(OD)，記錄結(jié)果并計算細胞抑制率：細胞抑制率=1-細胞存活率。

1.2.1.2 雙氫青蒿素作用時間對肺癌細胞生長影響 接種對數(shù)生長期的SPC-A-1細胞于96孔細胞培養(yǎng)板中，按每孔200 μl，調(diào)整細胞個數(shù)為每孔6×103個，37℃，培養(yǎng)24 h，加入濃度為29 μmol/L的雙氫青蒿素，同時設(shè)置陰性組和空白組，設(shè)置方法同1.2.1.1，分別經(jīng)過12、24、48、72和96 h作用時間后，用MTT法測量計算細胞的抑制率，測量及計算方法同1.2.1.1。

1.2.2 雙氫青蒿素誘導(dǎo)細胞凋亡作用

1.2.2.1 DNA ladder 檢測細胞凋亡 取處于對數(shù)期的SPC-A-1細胞與雙氫青蒿素濃度為29 μmol/L藥物相互作用，同時設(shè)置對照組，對照組中不加藥物，只加等量的DMSO(濃度為0.1%)，37℃，孵育48 h，收集細胞。在細胞中加入600 μl細胞裂解液后轉(zhuǎn)移至離心管中，冰浴1 h待細胞完全裂解后，12 000 r/min離心5 min，用平衡酚、酚/氯仿及氯仿分別抽提，取上清液，加入2倍體積的無水乙醇及0.1 mol/L的Nacl(使其終濃度為0.2 mmol/L)，在-20℃放置1 h，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入TE 10 μl和2 μl 濃度為10 mg/ml的RNase充分溶解。提取的DNA ladder經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后觀察并拍照。

1.2.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡 培養(yǎng)SPC-A-1細胞，待細胞生長至對數(shù)期，在細胞培養(yǎng)液中加入29 μmol/L的雙氫青蒿素，同時設(shè)置對照組不加雙氫青蒿素，加入0.1%DMSO，置于CO2培養(yǎng)箱中，37℃，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整待測細胞濃度為1×106個/ml，取1 ml細胞1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清液，加入預(yù)冷的PBS 1 ml懸浮細胞，1 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，用PBS重復(fù)洗滌1次，用Binding Buffer 200 μl重懸細胞，同時加入5 μl PI和10 μl Annexin-V，放置于室溫下，避光反應(yīng)15 min 后加入300 μl的緩沖液后，立即檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 雙氫青蒿素濃度對肺癌細胞生長的影響 隨著雙氫青蒿素的濃度的增大，3種不同的肺癌細胞系的細胞存活率明顯下降，雙氫青蒿素3種肺癌細胞的抑制率從大到小依次為：SPC-A-1、PC-14、Calua-3。肺癌細胞SPC-A-1在雙氫青蒿素的作用下細胞抑制率較PC-14、Calua-3大，利用軟件計算出細胞系SPC-A-1、PC-14、Calua-3的IC50分別為28.9、46.9、78.6μmol/L。見圖1。

圖1 雙氫青蒿素對肺癌細胞SPC-A-1、Calua-3、 PC-14增殖的影響

2.2 雙氫青蒿素作用時間對肺癌細胞的影響 雙氫青蒿素作用時間為12、24、48、72、96 h的細胞抑制率〔(0.21±0.03)、(0.28±0.02)、(0.47±0.06)、(0.62±0.07)、(0.73±0.09)〕較0 h(0)差異顯著(P<0.01)。說明隨著作用時間的加長，抑制增殖效果越強。

2.3 DNA ladder 檢測細胞凋亡情況 細胞凋亡時DNA在核小體間斷裂，形成的DNA片段，提取純化后，凝膠電泳呈現(xiàn)很多條帶。肺癌細胞SPC-A-1與雙氫青蒿素作用后，提取其DNA，瓊脂糖凝膠電泳后，與對照組相比出現(xiàn)很多條大小不同的亮帶，證明藥物作用后的SPC-A-1細胞出現(xiàn)了細胞凋亡。見圖2。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 經(jīng)藥物作用后的SPC-A-1細胞的凋亡率(0.59±0.12)較對照組(0.18±0.03)顯著增高(P<0.01)，這表明雙氫青蒿素抑制肺癌細胞SPC-A-1的增殖主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡所引起的。

圖2 經(jīng)雙氫青蒿素作用后的SPC-A-1細胞DNA ladder

3 討 論

雙氫青蒿素是由四氫硼鈉還原青蒿素而產(chǎn)生的，其結(jié)構(gòu)較為獨特。雙氫青蒿素具有抗腫瘤的作用，又因其安全無毒，成為近年來抗腫瘤藥物的熱點〔4〕。本研究結(jié)果表明，SPC-A-1、Calua-3、PC-14在雙氫青蒿素的作用下細胞存活率都有明顯的下降，隨著雙氫青蒿素濃度的增加。細胞凋亡是細胞為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在基因調(diào)控下發(fā)生的細胞死亡，細胞凋亡是主動的過程〔5～7〕。雙氫青蒿素對肺癌細胞具有明顯的抑制作用。細胞凋亡時，會形成非常多的DNA片段，這些DNA片段是由DNA核小體間斷裂形成的，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后會出現(xiàn)類似梯子一樣的條帶，是判斷細胞凋亡的重要標準。本研究證明肺癌細胞經(jīng)雙青蒿素作用后出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡，進一步驗證了雙青蒿素可以誘導(dǎo)細胞凋亡。 Annexin-V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸能親和結(jié)合，在正常的細胞內(nèi)，磷脂酰絲氨酸(PS)只存在于細胞膜脂質(zhì)內(nèi)側(cè)，在細胞凋亡早期，PS通過脂質(zhì)內(nèi)側(cè)逐漸向外側(cè)翻，最終會暴露于細胞外側(cè)，而Annexin-V會在細胞凋亡早期與暴露于細胞外側(cè)的PS結(jié)合，因此其是一種檢測細胞早期凋亡的非常靈敏的指標〔8～10〕。熒光標記的Annexin-V與PI雙染色，經(jīng)顯微鏡及流式細胞儀觀察，可以觀察細胞早期凋亡及晚期凋亡情況〔11〕。PC-A-1細胞與雙氫青蒿素作用后，經(jīng)Annexin-V與PI雙染色，結(jié)果更有力的證明了雙氫青蒿素主要通過誘導(dǎo)細胞凋亡而抑制細胞增殖。

1 Shen X，Zhuang Z，Zhang Y，etal.JARID1B modulates lung cancer cell proliferation and invasion by regulating p53 expression〔J〕.Tumour Biol，2015;36(9)：7133-42.

2 齊 磊，段永剛，丁英奇，等.Notch-1下調(diào)對雙氫青蒿素抗人骨肉瘤細胞株U-2OS存活率的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2015;31(12)：2120-5.

3 鄭紹琴，宋健平，王 琪.青蒿素類藥對A549和Hela細胞體外抗腫瘤活性的研究〔J〕.江西中醫(yī)藥，2014;45(2)：22-4.

4 黃 琰，吳 隼，張 媛.雙氫青蒿素誘導(dǎo)外周T細胞淋巴瘤Hut-78細胞凋亡及其可能的機制〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2016;23(1)：57-61.

5 王焰斌，楊旭東，李 剛.體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)患者心肌細胞凋亡基因表達的變化〔J〕.中華麻醉學(xué)雜志，2015;35(8)：913-8.

6 姜福瓊，王劍松，鄧丹琪.植物藥提取物影響腫瘤細胞凋亡信號通路的研究進展〔J〕.云南中醫(yī)中藥雜志，2015;36(3)：87-91.

7 李勝男，李 偉，周冬梅.血糖波動對糖尿病大鼠小腸上皮細胞凋亡的影響及可能機制 〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016;36(7)：1598-600.

8 湯穎俊，郭 青，智亞琴.CXCR4/STAT3在骨髓基質(zhì)細胞介導(dǎo)的急性髓系白血病耐藥中的作用研究〔J〕.中華血液學(xué)雜志，2016;37(2)：119-23.

9 陳 亮.成人原代肝細胞培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇后細胞凋亡的Annexin V/PI檢測及Fas表達〔D〕.長沙：湖南師范大學(xué)碩士論文，2015.

10 宋洪強，李雪芳，玄 燕.華半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶-3和β-連環(huán)蛋白、糖原合成激酶-3β在體外培養(yǎng)保存關(guān)節(jié)軟骨組織中的表達及其相關(guān)性〔J〕.中華實驗外科雜志，2016;33(1)：151-3.

11 舒 娟，劉曉菊，褚 旭.細顆粒物對慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬細胞吞噬功能的影響〔J〕.中華醫(yī)學(xué)雜志，2016;96(4)：301-5.

〔2016-12-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

湖北省自然科學(xué)基金資助(No.2012FKB04450)

周國運(1967-)，男，副主任藥師，主要從事中藥材鑒別、炮制及中藥制劑研發(fā)研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)08-1874-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.022

1 武漢市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科