長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性心力衰竭大鼠左室重構(gòu)的抑制作用

甄 潔

(鄭州大學(xué)體育系，河南 鄭州 450001)

長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)慢性心力衰竭大鼠左室重構(gòu)的抑制作用

甄 潔

(鄭州大學(xué)體育系，河南 鄭州 450001)

目的 觀察8 w運(yùn)動(dòng)對(duì)心力衰竭大鼠左室結(jié)構(gòu)、功能和重構(gòu)基因表達(dá)的影響，探討運(yùn)動(dòng)改善左室重構(gòu)的可能機(jī)制。方法 40只SD大鼠隨機(jī)分為心力衰竭對(duì)照組(HC組，n=10)、心力衰竭運(yùn)動(dòng)組(HE組，n=10)、假手術(shù)對(duì)照組(SC組，n=10)和假手術(shù)運(yùn)動(dòng)組(SE組，n=10)，心力衰竭模型采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)。HE組和SE組進(jìn)行8 w跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，SC組和HC組在鼠籠內(nèi)自由活動(dòng)。超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室結(jié)構(gòu)和功能；分離左室后行Masson染色法進(jìn)行組織病理學(xué)觀察并獲得膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)左室心肌心鈉素(ANF)、α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(SERCA2a)mRNA表達(dá)量。結(jié)果 ①與SC組比較，SE組大鼠左室出現(xiàn)離心性肥大，心功能提高，α-MHC和SERCA2a mRNA升高(P<0.05)；②與SC組比較，HC組左室出現(xiàn)向心性肥大，心功能降低，CVF明顯增加(P<0.05)，心肌α-MHC和SERCA2a mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，ANF和β-MHC mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；③與HC組比較，HE組大鼠左室發(fā)生離心性肥大，心功能提高，CVF明顯減少(P<0.05)，心肌α-MHC和SERCA2a mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，ANF和β-MHC mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)抑制心力衰竭大鼠左室重構(gòu)并改善心功能，其機(jī)制與心肌纖維化程度減輕、胚胎基因表達(dá)下調(diào)、收縮蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

運(yùn)動(dòng)；慢性心力衰竭；左室重構(gòu)

心力衰竭高患病率、高致殘率和高死亡率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量〔1〕。心力衰竭的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，近年研究認(rèn)為以神經(jīng)內(nèi)分泌為主、多種因素參與的以左室病理性重構(gòu)為主要特征的心臟負(fù)荷過(guò)度是心力衰竭發(fā)生最主要的原因〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)律運(yùn)動(dòng)特別是有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于穩(wěn)定期心力衰竭患者具有積極作用，可提高運(yùn)動(dòng)耐力并改善生活質(zhì)量〔3～6〕。此外，運(yùn)動(dòng)員經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，心臟出現(xiàn)生理性重構(gòu)并伴隨心功能提高〔7〕。運(yùn)動(dòng)對(duì)心力衰竭時(shí)左室病理重構(gòu)的影響以及運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理重構(gòu)在其中的作用鮮有關(guān)注，因此本研究以SD大鼠為受試對(duì)象，通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈造模，觀察8 w運(yùn)動(dòng)對(duì)左室結(jié)構(gòu)、功能和重構(gòu)基因表達(dá)的影響，探討運(yùn)動(dòng)改善左室重構(gòu)的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。

1.2 動(dòng)物分組與造模 將大鼠隨機(jī)分為心力衰竭對(duì)照組(HC組)、心力衰竭運(yùn)動(dòng)組(HE組)、假手術(shù)對(duì)照組(SC組)和假手術(shù)運(yùn)動(dòng)組(SE組)各10只。心力衰竭造模采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，方法為：腹腔麻醉后胸部備皮，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，在心尖搏動(dòng)處開(kāi)胸暴露心臟，0號(hào)絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，心電圖示心肌缺血性改變持續(xù) 30 min標(biāo)志手術(shù)成功，迅速放回心臟縫合胸壁。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素肌注以預(yù)防感染。SC組和SE組動(dòng)物開(kāi)胸后只栓線不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案 SC組和HC組動(dòng)物在鼠籠內(nèi)自由活動(dòng)，HE組和SE組在術(shù)后4 w開(kāi)始進(jìn)行跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練(10～15 m/min，坡度為0°，30 min/d，共5 d)，之后開(kāi)始正式訓(xùn)練，速度為16 m/min(50%～60%VO2max)，坡度為0°，60 min/d，5 d/w，共8 w。

1.4 左室結(jié)構(gòu)與功能檢測(cè) 末次訓(xùn)練后48 h，腹腔麻醉大鼠，胸部備皮，仰臥位固定，用小動(dòng)物超聲影像診斷系統(tǒng)(Vevo 770，加拿大visualsonics公司)進(jìn)行左室結(jié)構(gòu)與功能檢測(cè)，指標(biāo)包括左室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左室壁厚度(LVWT)、心率(HR)、左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.5 動(dòng)物取材 超聲檢測(cè)后稱(chēng)體重(BW)，迅速分離心臟，冷PBS洗凈稱(chēng)量心臟重量(HW)后分離左室，濾紙吸干，稱(chēng)量左室重量(LVW)，分別計(jì)算與體重比值為心臟重量指數(shù)(HWI)和左室心臟重量指數(shù)(LVWI)。取左側(cè)肺葉，稱(chēng)量得肺濕重，于干燥箱干燥24 h后稱(chēng)量肺干重，計(jì)算肺含水率(LWR)=(肺濕重-肺干重)/ 肺濕重×100%。切取左室非梗死區(qū)心肌，分成兩份，一份進(jìn)行心臟組織病理學(xué)觀察，另一份用于基因表達(dá)檢測(cè)。迅速將組織置于液氮中并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱凍存待測(cè)。

1.6 心臟組織病理學(xué)觀察 將左室心肌組織固定于10%的福爾馬林中，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片(5 μm)后行Masson染色，普通光鏡觀察各組心肌組織病理學(xué)變化。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，用圖像分析軟件測(cè)量膠原組織面積，膠原組織面積占所測(cè)視野面積的百分比即為膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。

1.7 mRNA表達(dá)檢測(cè) 將心室肌組織勻漿后，用Trizol法抽提心肌總RNA，用722型紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度并測(cè)定A260/A280比值(1.8～2.0為高純度)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(7300型熒光定量PCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司)測(cè)定心鈉素(ANF)、α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)和肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase，SERCA2a)mRNA表達(dá)量。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃/3 min；94℃/45 s，55℃/30 s，72℃/90 s，共35個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量(SC組的倍數(shù))。引物序列：ANF正義鏈5′-GGACTAGGCTGCAACAGCTTC-3′，反義鏈5′-GTGACACACCACAAGGGCTTA-3′；α-MHC正義鏈5′-ATCAAGGAGCTCACCTACCAG-3′，反義鏈5′-CACTCCTCATCGTGCATTTTC-3′；β-MHC正義鏈5′-ATGTGCCGGACCTTGGAA-3′，反義鏈5′-CCTCGGGTTAGCTGAGAGATCA-3′；SERCA2a正義鏈5′-CTGTGGAGACCCTTGGTTGT-3′，反義鏈5′-CAGAGCACAGATGGTGGCTA-3′；GAPDH正義鏈5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′，反義鏈5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 BW與心臟指數(shù) 與SC組比較，SE組和HE組HW、HWI、LVW、LVWI升高(P<0.05)；HC組HW、HWI、LVW、LVWI和LWR升高(P<0.05)；與HC組比較，HE組LWR降低(P<0.05)；所有組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2.2 左室結(jié)構(gòu)與功能 與SC組比較，SE組LVEDD、LVFS和LVEF升高P<0.05，HR降低(P<0.05)；HC和HE組LVEDD、LVFS和LVEF降低(P<0.05)，LVWT和HR升高(P<0.05)。與HC組比較，HE組LVEDD、LVFS和LVEF升高(P<0.05)，HR降低(P<0.05)；所有組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.3 心臟組織病理學(xué)改變 左室心肌Masson染色顯示：膠原纖維呈藍(lán)色，心肌細(xì)胞呈紅色。SC組和SE組心肌纖維著色均勻，無(wú)膠原成分；HC組心肌細(xì)胞減少，膠原成分顯著增多，纖維化程度明顯，CVF高于SC組(P<0.05)；HE組較HC組心肌細(xì)胞增多且排列較為整齊，膠原纖維(即CVF)明顯減少(P<0.05)，但仍高于SC組(P<0.05)。見(jiàn)圖1及表3。

表1 各組大鼠BW與心臟指數(shù)

與SC組比較：1)P<0.05；與HC組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠左室結(jié)構(gòu)與功能

2.4 mRNA表達(dá)的變化 與SC組比較，SE組α-MHC和SERCA2a升高(P<0.05)；HC組α-MHC和SERCA2a降低，ANF和β-MHC升高(P<0.05)。與HC組比較，HE組α-MHC和SERCA2a升高，ANF和β-MHC降低(P<0.05)；所有組間差異均顯著，見(jiàn)表3。

圖1 心肌Masson染色(×200)表3 各組心肌ANF mRNA表達(dá)和 β-MHC、α-MHC、SERCA2a、CVF變化

組別ANFβ-MHCα-MHCSERCA2aCVF(%)SC組1.00±0.180.98±0.150.99±0.191.02±0.185.8±1.3SE組0.97±0.191.16±0.211.63±0.301)1.52±0.281)5.1±1.5HC組2.21±0.511)1.78±0.381)0.32±0.091)0.41±0.081)20.2±4.91)HE組1.22±0.302)1.31±0.282)0.81±0.102)0.76±0.082)13.1±2.21)2)

3 討 論

近年研究認(rèn)為，左室病理性重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展最重要的病理生理學(xué)機(jī)制〔8〕。左室肥大和心功能下降是左室病理重構(gòu)的主要標(biāo)志〔9〕。本研究提示心力衰竭后發(fā)生病理性心臟肥大，表現(xiàn)為心臟重量和左室重量增加、心腔縮小、心壁增厚，即向心性肥大，收縮功能隨之降低，肺水腫明顯。胚胎基因重新激活是心肌肥大發(fā)生的重要機(jī)制，其中MHC和ANF是心肌肥大的分子標(biāo)志物，其表達(dá)水平能影響心肌功能和預(yù)后，在左室重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔10〕。MHC由兩種基因α-MHC和β-MHC編碼，前者ATP酶活性高，肌肉收縮速率最快，后者則相反，調(diào)節(jié)二者的轉(zhuǎn)換對(duì)調(diào)節(jié)心肌收縮功能至關(guān)重要〔11〕。成年心室肌肌球蛋白α-MHC占優(yōu)勢(shì)，胚胎期則以β-MHC為主〔12〕。ANF具有抗氧化作用，其表達(dá)水平與心力衰竭程度正相關(guān)〔13〕。本研究提示心力衰竭時(shí)肌球蛋白ATP酶活性降低，心肌收縮力下降。此外，SERCA2a是一種鈣離子泵(收縮蛋白)，可將胞質(zhì)中的Ca2+逆濃度梯度泵入肌漿網(wǎng)，參與對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)〔14〕。本研究中HC組SERCA2a表達(dá)下降，不僅導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，而且影響心臟的舒縮功能。心肌細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積是左室重構(gòu)的另一特征〔15〕。心肌細(xì)胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成，其生理功能在于為心肌細(xì)胞提供支持、傳導(dǎo)應(yīng)力并保證心肌順應(yīng)性〔16〕。本研究中，HC組心肌Masson染色顯示心肌細(xì)胞變性壞死、膠原成分明顯增多，CVF升高，纖維化程度明顯。研究表明，膠原由正常的3%增至10%時(shí)，心室壁順應(yīng)性明顯下降，舒張功能受限，超過(guò)20%則出現(xiàn)心肌細(xì)胞被阻隔，收縮功能明顯下降〔17〕。此外，心肌纖維化可增加心肌電異質(zhì)性，是造成心律失常和猝死原因之一〔18〕。

與左室病理性重構(gòu)不同，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的心臟肥大(運(yùn)動(dòng)性心臟肥大或運(yùn)動(dòng)員心臟)是心臟對(duì)于運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的良性適應(yīng)，屬于生理性重構(gòu)〔19～21〕。本研究提示長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)左室出現(xiàn)離心性肥大，即心腔擴(kuò)大，室壁增厚不明顯。由于心功能增強(qiáng)(LVFS和LVEF增加，HR降低)，因此這種結(jié)構(gòu)變化屬于生理性肥大。在基因水平上，胚胎基因(ANP和β-MHC)無(wú)明顯變化，收縮蛋白基因(α-MHC和SERCA2a)表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)運(yùn)動(dòng)性心臟肥大是對(duì)長(zhǎng)期訓(xùn)練適應(yīng)的結(jié)果〔22〕。運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的左室生理重構(gòu)在心力衰竭康復(fù)中的作用尚無(wú)定論，本研究顯示左室心力衰竭時(shí)“向心性肥大”經(jīng)過(guò)運(yùn)動(dòng)康復(fù)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椤半x心性肥大”，其機(jī)制可能與有氧運(yùn)動(dòng)增加心臟前負(fù)荷有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)〔23〕，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)(如長(zhǎng)跑或游泳等耐力型運(yùn)動(dòng)員)通過(guò)增加回心血量(即心臟前負(fù)荷或容量負(fù)荷)造成心室壁應(yīng)力增大，引起心肌細(xì)胞肌節(jié)串聯(lián)排列為主，心臟擴(kuò)大以適應(yīng)增加的容量負(fù)荷。本研究提示，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的左室生理性重構(gòu)與病理性重構(gòu)在心力衰竭大鼠運(yùn)動(dòng)康復(fù)過(guò)程中同時(shí)存在并相互抗衡〔24〕，最終前者的良性作用逆轉(zhuǎn)了后者的負(fù)面效應(yīng)，表現(xiàn)為左室結(jié)構(gòu)由病理性肥大向生理性肥大轉(zhuǎn)變。因此，長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)抑制心力衰竭時(shí)左室重構(gòu)改善心功能。這一結(jié)論在Garciarena等〔25〕針對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的研究中也得到進(jìn)一步證實(shí)，提示心力衰竭患者在運(yùn)動(dòng)康復(fù)過(guò)程中，即使在原有心臟病理肥大(如高血壓或心肌梗死造成的心臟向心性肥大)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)離心性肥大，其堅(jiān)持運(yùn)動(dòng)的收益可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于風(fēng)險(xiǎn)。

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〔2015-12-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河南省體育局項(xiàng)目(HT2013-05)

甄 潔(1973-)，女，講師，碩士，主要從事運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)研究。

G804.5

A

1005-9202(2017)08-1881-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.025