DNA甲基結合蛋白2調節少突膠質前體細胞終末分化的作用及機制

孫龍云

(張家口學院醫學系，河北 張家口 075000)

DNA甲基結合蛋白2調節少突膠質前體細胞終末分化的作用及機制

孫龍云

(張家口學院醫學系，河北 張家口 075000)

目的 探究DNA甲基結合蛋白(MeCP)2調節少突膠質前體細胞(OPCs)終末分化的作用及機制。方法 ①采用Western印跡方法觀察MeCP2沉默對OPCs分化成熟的影響；②運用甲基特異性聚合酶鏈反應(PCR)(BSP)和定量實時PCR(qRT-PCR)探究少突終末標志物內轉錄因子Sry相關Box17因子(SOX)10、DNA甲基結合蛋白(MBP)、髓鞘相關糖蛋白(MAG)、髓鞘脂蛋白(PLP)甲基化和表達變化。結果 與正常細胞相比，在MeCP2沉默的OPCs中，與OPCs分化成熟相關2',3'-環核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP)重組蛋白表達明顯上調，同時SOX10、MBP、MAG、PLP表達均明顯上調；但呈現低甲基化水平。結論 MeCP2沉默可促進OPCs終末分化標志物的表達及甲基化水平的降低，從而促進OPCs成熟分化。

DNA甲基結合蛋白(MeCP)2；少突膠質前體細胞；終末分化

髓鞘異常是導致老年腦組織退行性病變的主要元素，不可避免的脫髓鞘直接導致腦神經功能退化，最終引起老年癡呆。少突膠質細胞的主要功能是在中樞神經系統中包繞軸突、形成絕緣的髓鞘結構、維持和保護神經元的正常功能。少突膠質前體細胞(OPCs)分化成熟異常是導致髓鞘異常的直接原因，OPCs分化成熟是中樞神經髓鞘形成的關鍵環節,但其調控機制不清。OPCs分化成熟受遺傳和環境因素共同調控，DNA甲基化是最早被發現的一種表觀遺傳修飾，其不涉及DNA序列的改變，但可調節基因的表達。研究顯示DNA甲基化在OPCs分化成熟和髄鞘再生障礙中發揮了重要作用〔1〕。DNA甲基化的主要途徑是在DNA甲基化轉移酶的作用下，通過DNA甲基結合蛋白(MBP)募集相關分子形成復合物，抑制基因表達〔2〕。DNA甲基化可以使DNA在甲基轉移酶的作用下，堿基C(胞嘧啶)的5號碳原子上添加一個甲基的變化。在少突膠質細胞終末分化階段中特異敲除DNA甲基結合蛋白(MeCP)2，髓鞘厚度明顯變薄，并且有研究提示MeCP2可能在少突膠質細胞(OLs)的分化成熟和髓鞘形成中發揮了關鍵作用〔3〕。本研究擬闡明MeCP2在OPCs分化成熟和髓鞘形成過程中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、培養基與試劑 大鼠OPCs系QLN-9細胞(美國模式生物庫ATCC)，培養基DMEM，0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS)(Gibco公司)。主要試劑:阿司匹林，順鉑，雙抗-青鏈霉素，Trizol核酸裂解液，逆轉錄試劑盒，定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒(碧云天公司)。其中shRNA-MeCP2的模板序列如下：正義鏈：5'-GACTGGACCTGAGTTACGTCATTCAATAAAVCTGAAGTTCCTTACTATATGTCCTTTTTTG-3'；反義鏈：5'-CTGACTATAAAGAAGCCAAGGAAGTTGTTCTCTCTTCAAGGAATGACGTACACGTGGCTCC-3'，過程中所使用的克隆載體是pGPU5/GFP/Neo(美國Santa Cruz公司)。

1.2 細胞培養 培養箱二氧化碳濃度為5%、溫度37℃條件下，分別用DMEM(含10%FBS及雙抗)完全培養基培養大鼠OPCs系QLN-9細胞。

1.3 提取RNA 0.25%胰蛋白酶收集對數期細胞，加入適量Trizol，冰上孵育15 min、12 000 r/min離心10 min，75%乙醇清洗沉淀，沉淀溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水，存于-70℃。

1.4 Western印跡檢測 一抗：tubulin配置比例為1∶10 000，MeCP2為1∶200,2'-3'-環核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP)為1∶200；二抗，Tubulin配置比例為1∶10 000,MeCP2,CNP為1∶5 000。

1.5 甲基特異性PCR 提取總RNA反轉錄成cDNA,進行甲基特異性PCR反應。反應條件：95℃預變性10 min(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40循環，72℃末次延伸5 min。取PCR結果行瓊脂糖凝膠電泳。若目的基因啟動子CPG島完全發生甲基化，則僅在完全甲基化引物下出現條帶；若目的基因啟動子CPG島完全不發生甲基化，則僅在無甲基化引物下出現條帶；若目的基因啟動子CPG島不完全發生甲基化，則兩個引物下均可出現條帶。

1.6 實時qPCR 提取總RNA反轉錄成cDNA,進行熒光qPCR反應。反應條件：95℃預變性10 min(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)×40循環，72℃末次延伸5 min。采用2-ΔCT法進行相對定量分析。

1.7 統計學方法 采用GRAPH PAD6.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 MeCP2沉默可促進OPCs成熟分化 體外培養OPCs 1 w后，細胞逐漸由纖維狀、螺旋生長形態轉為上皮形態。與正常細胞相比，在MeCP2沉默的OPCs中，CNP蛋白的表達明顯上調，提示MeCP2沉默可促進OPCs成熟分化。見圖1。

圖1 MeCP2沉默可促進OPCs成熟分化(Western印跡)

2.2 MeCP2沉默可促進OPCs終末分化標志物表達及甲基化水平降低 MeCP2沉默促進SOX10、MBP、MAG、PLP表達均明顯上調(P<0.05)；SOX10、MBP、MAG、PLP均呈現低甲基化水平，除SOX10外，其他均差異顯著(P<0.05)。見表1，表2。

表1 OPCs終末分化標志物mRNA相對表達量

與對照組比較：1)P<0.05

表2 甲基特異性PCR示OPCs終末分化 標志物甲基化水平

3 討 論

OLs是中樞神經系統(CNS)髓鞘形成細胞。中樞神經髓鞘的完整性保證了神經信息精確、高效傳遞,對中樞信息整合發揮重要作用，多種神經精神疾病如Pett綜合征(RTT)、多發性硬化癥、精神分裂癥等都有髓鞘的異常,特別是隨著年紀的增長，髓鞘的脫失與老年癡呆密切相關。OPCs分化成熟異常是導致髓鞘異常的直接原因。

DNA甲基化是最早被發現的一種表觀遺傳修飾，是指在DNA甲基轉移酶的催化下，利用S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基,將胞嘧啶的第5 位碳原子甲基化,使之轉化為5-甲基胞嘧啶(5mC)的過程，常見于基因的CG序列。一般認為甲基化程度高，基因的表達則低。DNA甲基轉移酶包括Dnmt1，Dnmt3a和Dnmt3b。Dnmt1，Dnmt3b對早期的神經系統發育有重要作用。Dnmt1的缺失會導致基因的大面積低甲基化。在Dnmt3a缺失的神經干細胞系中，OLs相關基因比如血小板衍生生長因子受體(PDGFR)α,Olig1,SOX10,MBP,Id2/4,Nkx 2.2等表達有明顯的降低，研究發現〔4〕在少突膠質譜系中Dnmt3a，Dnmt1和Dnmt3b主要在神經元中表達。MAG基因的兩個Hpa2位點隨OLs分化的過程逐漸發生去甲基化。OLs分化特異的轉錄因子SOX10在精神分裂癥患者的大腦高度甲基化，SOX10低表達。從多發性硬化癥患者腦白質分離的DNA中，發現OLs相關基因PAD2存在高甲基化現象，表達下調,以上結果顯示DNA甲基化調控了OLs分化成熟和髓鞘再生障礙。

DNA甲基化的主要作用途徑是:在DNA甲基化轉移酶的作用下，通過MBP募集組蛋白去乙酰化酶(HDACs)、共抑制子等形成抑制復合物，阻止轉錄因子與其特定DNA序列結合,從而抑制基因的表達。MBP主要有MBP1～4、MeCP2和Kaiso。MeCP2位于染色體Xq28，包含4個外顯子和3個內含子，MeCP2轉錄后形成 MeCP2-e1和MeCP2-e2兩種剪切體。兩種剪切體分別從外顯子1和2開始轉錄,產生的蛋白整體結構差異微小。MeCP2外顯子1突變可導致典型的RTT。MeCP2蛋白有3個主要的功能域:CpG結合域、轉錄抑制域和C-末端域,MeCP2介導的轉錄抑制主要通過與甲基化的DNA相互作用產生,由MBP區識別位于基因啟動子區的甲基化CpG雙核苷,通過轉錄抑制區(TRD)募集轉錄抑制因子Sin3A和組蛋白去乙酰化酶共同組成轉錄抑制復合物，從而抑制下游基因表達〔5〕。

MeCP2的缺失可導致RTT。RTT是一種X連鎖的疾病，主要累及女孩，導致智力低下、類似自閉癥等神經系統異常，晚期還會出現骨骼病變，脊柱強直等癥狀〔6〕，臨床上尚無有效治療藥物。RTT綜合征在發病的早期即有白質的病變，白質主要為神經纖維〔7〕，而OLs正是形成神經纖維的細胞，OLs異常是該病的重要發病機制之一。研究顯示，MeCP2敲除小鼠表現出與RTT相似的癥狀，MeCP2基因在OLs中恢復表達后，小鼠運動能力明顯提升，同時相比較于MeCP2在星形膠質細胞和小膠質細胞中恢復表達，能夠更多延長小鼠的壽命〔8～10〕。

研究發現MeCP2敲除小鼠的大腦胼胝體中,髓鞘厚度明顯下降〔11〕。課題組在北京師范大學章曉輝教授實驗室引進MeCP2敲除小鼠(B6.129P2-MeCP2tm1Bird/J)，成功進行了培育并得到了MeCP2敲除的小鼠,發現MeCP2敲除的小鼠髓鞘厚度顯著下降。提示MeCP2可能影響OPCs的終末分化成熟和髓鞘的形成〔12～14〕。綜上，MeCP2可能在OPCs分化的終末階段發揮了重要作用，通過調控少突終末分化相關基因的甲基化來調控OLs終末分化和髓鞘的形成。MeCP2沉默可促進OPCs終末分化標志物的表達及甲基化水平的降低，從而促進OPCs成熟分化。

1 譚衛星.miR-126-3p在少突膠質前體細胞分化和髓鞘再生中的作用及機制研究〔D〕.上海：第二軍醫大學,2015.

2 Kulis M,Esteller M.DNA methylation and cancer〔J〕.Adv Genetics,2010;70:27-56.

3 翁 超,盧祖能,符 輝.少突膠質細胞分化發育與髓鞘形成的研究進展〔J〕.中華神經醫學雜志,2016；15(5):524-8.

4 Sheikh MA.DNA甲基轉移酶3b新靶點的鑒定及其在神經元分化中表達的調節及功能研究〔D〕.長春：東北師范大學,2013.

5 Cheng PY,Lin YP,Chen YL,etal.Interplay between SIN3A and STAT3 mediates chromatin conformational changes and GFAP expression during cellular differentiation〔J〕.PLoS One,2011;6:e22018.

6 Amir RE,Van den Veyver IB,Wan M,etal.Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MeCP2,encoding methyl-CpG-binding protein 2〔J〕.Nat Genet,1999;23:185-8.

7 Durand T,De Felice C,Signorini C,etal.F2-Dihomo-isoprostanes and brain white matter damage in stage 1 Rett syndrome〔J〕.Biochimie,2013;95(1):86-90.

8 Wu W,Gu W,Xu X,etal.Downregulation of CNPase in a MeCP2 deficient mouse model of Rett syndrome〔J〕.Neurol Res,2012;34(2):107-13.

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10 Nguyen MV,Felice CA,Du F,etal.Oligodendrocyte lineage cells contribute unique features to Rett syndrome neuropathology〔J〕.J Neurosci,2013;33(48):18764-74.

11 鄧醫宇,朱高峰,曾紅科,等.G蛋白偶聯受體56對小鼠腦胼胝體軸突髓鞘化的影響〔J〕.臨床神經病學雜志,2014；27(6):437-41.

12 Forbes-Lorman RM,Kurian JR.MeCP2 regulates GFAP expression within the developing brain〔J〕.Brain Res,2014;1543(2):151.

13 Singleton MK,Gonzales ML,Leung KN,etal.MeCP2 is required for global heterochromatic and nucleolar changes during activity-dependent neuronal maturation〔J〕.Neurobiol Dis,2011;43(1):190-200.

14 Nguyen MV,Du F,Felice CA,etal.MeCP2 is critical for maintaining mature neuronal networks and global brain anatomy during late stages of postnatal brain development and in the mature adult brain〔J〕.J Neurosci,2012;32(29):10021-34.

〔2015-05-27修回〕

(編輯 苑云杰)

孫龍云(1981-)，男，講師，醫學碩士，主要從事人體解剖與組織胚胎學研究。

R329

A

1005-9202(2017)08-1886-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.08.027