銅綠假單胞菌SU8發酵液與乙蒜素混配對草莓灰霉病的防效

楚文琢+彭雙強++廖曉蘭+馬文月

摘要：用拮抗細菌銅綠假單胞菌SU8的發酵液和乙蒜素乳油進行混配以期達到有效防治草莓灰霉病的目的，分別從SU8發酵液與乙蒜素乳油混配的室內毒力、孢子萌發抑制率和盆栽防效試驗等3個方面進行研究。結果表明，SU8發酵液對草莓灰霉病菌的最小抑菌濃度（MIC）為12.50 mg/L，EC50為1 696.4 mg/L，乙蒜素乳油對草霉灰霉病菌的MIC為6.25 mg/L，EC50為143.4 mg/L；當兩者以質量比1 ∶9混配時，增效系數為1.04，表現為協同作用，當兩者分別以質量比1 ∶4、1 ∶1、4：1、9 ∶1混配時，增效系數分別達到了1.53、2.33、5.41、8.41，均表現出明顯的增效作用；在對病菌孢子萌發抑制方面，在12、24、36 h內，乙蒜素乳油的抑制率分別為60.9%、58.4%、47.0%，低于兩者質量比 4 ∶1 、 9 ∶1 混合組配；在盆載試驗中，乙蒜素乳油的防病效果也比兩者質量比4 ∶1、9 ∶1混合組配低。由結果可知，與SU8發酵液混配，能極顯著增強乙蒜素對草莓灰霉病的防治效果。

關鍵詞：SU8發酵液；乙蒜素乳油；混配；增效作用；草霉灰霉病菌；防治

中圖分類號： S436.68+4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）06-0079-04

草莓灰霉病（Botrytis cinerea）是影響我國草莓生產的一種常見病害，其病原菌屬灰葡萄孢菌，為腐生致病菌，可以侵染番茄、茄子、黃瓜、西葫蘆、草莓、葡萄、蘋果、菜豆等多種作物[1-3]。該病菌感染植株后，若不能得到有效控制，一般情況下會致使草莓減產10%～20%，嚴重時往往導致草莓植株葉片干枯、果實出現斑點或腐爛，甚至整株死亡，減產率高達70%～80%[4-5]，嚴重影響草莓的產量與質量，造成重大經濟損失。目前，農業生產上對灰霉病的防治主要依賴多菌靈、腐霉利等化學藥劑[6-9]。然而，這些化學藥劑在取得較好防治效果的同時，由于灰霉病菌具有寄主范圍廣、繁殖速度快、遺傳變異性大和適應性強的特點，極易產生抗藥性，并且在化學藥劑的長期使用過程中，其抗藥性也不斷增強[10-18]，這些特性使得化學藥劑對草莓灰霉病的防治效果下降很快[19-22]。因此，在生產過程中，為了增強對灰霉病的防治效果，往往采用增大劑量或者增加施藥次數的措施，這種措施可能會導致草莓本身藥劑殘留量超標，最終危及人畜健康，影響我國草莓生產與出口，非常不利于我國當前綠色農業和生態農業的發展要求[23]。尤其是我國加入世界貿易組織（WTO）后，世界對我國農副產品出口提出了更高的要求。因此，我國的草莓種植業迫切需要一些符合我國農業發展的新型途徑來有效控制灰霉病的發生與蔓延。

生物防治具有低污染、低殘留、低成本的特點，正逐漸成為灰霉病控制中一條重要有效的途徑[24-25]。近幾十年來，國內外專家進行了大量研究，篩選出具有抑制灰霉病菌的拮抗細菌，發現當前常見的灰霉病拮抗菌株主要為木霉、酵母菌、芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和放線菌等[26-29]。然而，大量報道也表明，單一的生物防治因菌株具有極大的變異性而導致防治效果不穩定。研究也發現，將拮抗細菌與化學藥劑混配對延緩病原菌的抗藥性、提高藥劑對病原菌的防治效果有一定的作用。例如，周榮金等將不同的拮抗細菌混配能有效提高對灰霉病的防效，對灰霉病的防治具有顯著增效作用[30]；張紅娟等從核桃上分離得到的2株內生菌HT3與HT5分別與速克靈藥劑混配能有效增強對灰霉病菌的抑制作用[31]。但目前利用拮抗細菌發酵液和植物源殺菌劑混配來防治草莓灰霉病的報道罕見。筆者所在實驗室從稻鴨共養田中分離出1株對水稻紋枯病菌（Rhizoctoria solani）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）等多種真菌具有較強拮抗效果的銅綠假單胞菌SU8，研究發現其發酵液乙酸乙酯提取物也有同樣的抑菌效果[32]。此外，有研究表明，大蒜提取物對草莓灰霉病菌有較好的抑制效果，并且農業生產中以大蒜提取物為原料合成的仿生農藥——乙蒜素乳油對包括草莓灰霉病在內的多種病害均具有顯著防治效果[33-34]。基于此，本研究擬用乙蒜素乳油和SU8發酵液混配來開展試驗，以期拓寬對該病的防治途徑，為防治草莓灰霉病提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株為由湖南農業大學植物保護學院植物病理學實驗室篩選分離的SU8拮抗細菌和草莓灰霉病菌。供試藥劑為80%乙蒜素乳油（北京中農佳瑞有限公司）。試驗植株為易感灰霉病品種豐香。

供試培養基：（1）PDA培養基，200 g馬鈴薯、15 g葡萄糖、17 g瓊脂，pH值自然 ；（2）馬鈴薯葡萄糖培養液：除不加瓊脂外，其余同PDA培養基；（3）NA培養基：10 g牛肉浸膏、10 g蛋白胨、5 g氯化鈉、17 g瓊脂，pH值為7.0～7.2；（4）NB培養液：除不加瓊脂外，其余同NA培養基。上述培養基均加水定容至1 L，于1.01×106 Pa、121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2試驗方法

1.2.1拮抗菌SU8發酵液的制備將拮抗菌SU8在NA培養基上活化后，用接種環取1環于10 mL無菌水中攪拌均勻，做成菌體懸浮液。取NB培養液與10% 上述SU8菌體懸浮液于搖瓶中，在磁力攪拌機上，28 ℃、220 r/min振蕩連續培養120 h，得到SU8發酵液。

取適量發酵液，用旋轉蒸發儀于100 r/min、60 ℃恒溫條件下濃縮至原來體積的1/10。再將10倍濃縮液在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心20 min，取上層液體，得到SU8發酵液粗濾液。用細菌過濾器（0.22 μm）逐步過濾除菌后的無菌發酵液，即為SU8發酵液（濃度視為 1 g/mL，以下簡稱SU8發酵液），置于4 ℃，保存備用。

1.2.2拮抗效果與拮抗活性的測定（1）SU8菌對草莓灰霉病菌的拮抗效果。試驗采用對峙培養法：在無菌工作臺上，用融化的PDA培養基制作成直徑為7 cm的PDA平板。用SU8菌體懸浮液將滅過菌的濾紙片（直徑為0.5 cm）潤濕，置于PDA平板的一側。同時，在PDA平板的另一側對稱性地放置1個直徑為0.5 cm的草莓灰霉病菌菌餅，25 ℃培養箱中連續培養72 h。觀察草莓灰霉病菌菌落生長情況并測定抑菌帶寬度，每個處理3次重復。

（2）SU8發酵液和乙蒜素乳油對草莓灰霉病菌的拮抗活性測定。取草莓灰霉病菌菌餅（直徑為0.5 cm）接種于PDA平板的中央，25 ℃下培養24 h后在新長出的菌絲兩側對稱打孔（直徑為0.5 cm）。挑出孔內基質后，在其中的1個孔內加入適量的SU8發酵液（濃度為1 g/mL），在對稱的另1個孔內加入等量的無菌水作對照。乙蒜素乳油（無菌水稀釋100倍，濃度視為1 g/mL，下同）作相同的處理。25 ℃培養72 h后，觀察草莓灰霉病菌菌落生長情況并測定抑菌帶寬度，每個處理3次重復。

1.2.3室內毒力測定（1）最小抑菌濃度（MIC）測定。參照黃彰新菌絲生長速率法[35]進行MIC測定并稍作修改。其具體操作如下：在無菌工作臺上，用無菌水分別將SU8發酵液和乙蒜素乳油配制成1 000.0、750.0、500.0、250.0、125.0、62.5 mg/L的6種不同濃度，4 ℃下保存備用。在9.0 mL熱培養基中，分別加入1.0 mL不同濃度的2種物質，以加1 mL水為對照，搖勻制成平板；接種同時活化的灰霉病菌菌餅（直徑0.5 cm），使帶菌絲的一面貼在培養基表面，置于25 ℃的培養箱中恒溫培養。待對照菌絲長至培養皿的2/3面積時，用十字相乘法測定菌落直徑，每個處理3次重復。以不長菌處理藥劑的最低濃度為最小抑菌濃度。

（2）菌絲生長抑制率的測定。在最小抑菌濃度的基礎上，分別取相應濃度的SU8發酵液與乙蒜素乳油以質量比 1 ∶9、1 ∶4、1 ∶1、4 ∶1、9 ∶1進行混配，每個混合組配配制5種不同的梯度濃度，置于4 ℃保存備用。參照菌絲生長速率法計算藥劑的菌絲生長抑制率，每個處理3次重復。通過公式計算藥劑對菌絲生長的抑制率，并采用Wadley的增效比率法[36]計算2種物質的毒力回歸方程和混合組配的增效系數，相應公式：

相對抑制率= 對照菌落直徑-處理菌落直徑1對照菌落直徑-菌餅直徑×100%；

混劑的理論EC（th）50=a+b1（a/A的EC50+b/B的EC50）；

增效系數（SR） = 混劑的EC（th）501混劑的EC50。

式中：菌落生長直徑為測量直徑減去0.5 cm的菌餅直徑，cm；A為SU8發酵液；B為80%乙蒜素乳油；a、b分別為SU8發酵液、80%乙蒜素乳油在混合組配物總質量中的比例，%。

根據增效系數（SR）進行聯合作用綜合評價。當0.5

1.2.4孢子萌發抑制活性的測定采用孢子萌發法[37]測定孢子萌發抑制活性。在無菌條件下，分別配制濃度為 500 mg/L 乙蒜素乳油、濃度為2 000 mg/L SU8發酵液，再取適量SU8發酵液和乙蒜素乳油按質量比4 ∶1、9 ∶1進行混配，得到混合組配，置于4 ℃保存備用。將病原菌培養8 d，待其產孢后，加無菌水 5 mL，在培養基表面用接種針輕輕摩擦，使病原菌孢子懸浮于水中，將培養基塊和菌絲體用紗布過濾，制成2萬個/mL的孢子懸浮液。分別取各藥劑與孢子懸浮液等體積充分混合，以無菌水作空白對照滴加在潔凈的凹玻片上。在25 ℃恒溫條件下培養，分別培養12、24、36 h后，在40倍物鏡下鏡檢孢子萌發情況（以孢子芽管的長度超過孢子直徑的50%視為已萌發孢子），檢查各個處理孢子萌發情況，并計算萌發率和抑制率，每個處理重復3次，相應公式：

孢子萌發率=孢子萌發數/總孢子數×100%；

孢子萌發抑制率=（CK孢子萌發數-藥劑處理孢子萌發數）/對照孢子萌發數×100%。

1.2.5盆栽防效試驗試驗于2015年5月中旬—7月上旬草莓育苗期間，從草莓種植區大棚內移取適量的泥土，經無菌處理后，盛裝在口徑為40 cm、高為25 cm的花盆中至盆高的2/3。選取生長狀況較一致的1年生豐香草莓3葉期幼苗數株均勻移植于花盆中，2盆之間的間距為10 cm，其他同常規管理。待其成活后，將草莓灰霉病菌發酵液制成2 000萬CFU/mL，每株2 mL均勻噴施于草莓葉面。在人工氣候箱（溫度25 ℃、相應濕度90%）中培養3～4 d，待草莓植株完全發病后調查病情指數。分別噴施“1.2.4”節所配制的各藥劑，以無菌水作空白對照（CK）。每處理20株，連續施藥2次，第1次施藥與第2次施藥間隔7 d。噴藥后7 d分別觀察記錄草莓植株發病情況。

參照農業部農藥檢定所編寫的《農藥田間藥效試驗準則》對病害進行分級，并計算病情指數和防治效果。病情分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占整個葉面積5%及以下；3級，病斑面積占整個葉面積6%～10%；5級，病斑面積占整個葉面積11%～20%；7級，病斑面積占整個葉面積21%～50%；9級，病斑面積占整個葉面積50%以上。相應公式：

病葉率=調查病葉數/調查總葉數×100%；

病情指數=[∑（各級病葉數×相對級數值）/（調查病葉數×最高級數值）]×100；

防治效果=（對照區病情指數-處理區病情指數）/對照區病情指數×100%。

1.2.6數據處理 采用Excel、DPS軟件進行數據處理，用新復極差法進行差異顯著性分析（α=0.05，α=0.01）。

2結果與分析

2.1拮抗活性的測定

2.1.1SU8菌對草莓灰霉病菌的拮抗效果對峙培養法測得SU8菌對草莓灰霉病菌的抑菌帶寬為3.26 cm。該結果表明SU8菌對草莓灰霉病菌具有較強的拮抗效果，與張亞等的研究結果[32]一致。

2.1.2SU8發酵液和乙蒜素乳油對草莓灰霉病菌的拮抗效果由表1可知，SU8發酵液和乙蒜素乳油對草莓灰霉病菌均具有抑制作用。

2.2室內毒力測定

利用菌絲生長速率法進行SU8發酵液與乙蒜素乳油混配的室內毒力測定。結果表明，SU8發酵液與乙蒜素乳油對草莓灰霉病菌的最小抑菌濃度分別為12.50、6.25 mg/L。由表2可知，SU8發酵液對草莓灰霉病病菌的EC50為1 696.4 mg/L，乙蒜素乳油對草莓灰霉病病菌的EC50為1434 mg/L，2種物質以質量比為1 ∶9、1 ∶4、1 ∶1、4 ∶1、9 ∶1混合組配的EC50分別為151.4、114.2、113.6、98.9、96.6 mg/L，其增效系數分別為1.04、1.53、2.33、5.41、8.41。

根據增效系數的聯合評價標準可知，2種物質以質量比 9 ∶1 混合組配為協同作用；2種物質以質量比1 ∶4、1 ∶1、4 ∶1、9 ∶1混合組配為增效作用，且以質量比為 9 ∶1、4 ∶1的混合組配增效作用較為明顯。

2.3孢子萌發活性抑制測定

表3結果表明，隨著時間的增加，病菌孢子萌發率逐漸提高，但不同藥劑對病菌孢子萌發的影響不同。在12、24、36 h內，病菌孢子在單一的SU8發酵液中萌發率最高，分別為605%、82.1%、88.5%，均高于其他藥劑處理，而以SU8發酵液與乙蒜素乳油按質量比9 ∶1混合組配最低，其萌發率分別為8.5%、13.6%、21.8%。比較它們的孢子萌發抑制率可知，在不同的時間段內以單一的SU8發酵液處理對孢子萌發的抑制率最低，但當SU8發酵液與乙蒜素乳油以質量比 4 ∶1、9 ∶1混配后，2種混合組配對孢子萌發的抑制率均明顯高于前2者，其中又以質量比9 ∶1的混合組配最高（表3）。

2.4盆栽防效試驗

由表4可知，2次施藥，單一乙蒜素乳油防病效果分別為54.7%、47.1%，單一SU8發酵液防病效果分別為8.2%、64%，但均低于同濃度乙蒜素乳油和SU8發酵液2者質量比4 ∶1、9 ∶1混合組配的防病效果，且差異極顯著。

3結論與討論

3.1結論

本研究再一次明確了拮抗細菌SU8的發酵液對草莓灰霉病菌具有較強的抑制效果，且混配的各項試驗結果均表明，乙蒜素乳油與SU8發酵液以質量比4 ∶1、9 ∶1混配對草莓灰霉病的防治效果比其單一藥劑要好，且以2者質量比9 ∶1混配效果最好。這一結果明確了與SU8發酵液混配，能顯著增強乙蒜素乳油對草莓灰霉病的防治效果，并有力論證了銅綠假單胞菌株SU8成為生物農藥的可能性，明確了拮抗菌在農業生產病害防治中的重要地位，也表明混配是防治草莓灰霉病的有效途徑，為今后防治草莓灰霉病提供了新思路，值得更廣范圍地研究與推廣。尤其是本研究利用2種對環境無污染的生防物質混配，在取得較好防治效果的同時，又明確了2種物質的具體混配比例，為今后劑型的研發與推廣提供了試驗數據。

3.2討論

生物防治具有低毒、低殘留、易降解的特點，并且與環境相容，正逐漸成為生產無公害農產品時防治病害的首選[38]。因此，生物農藥的研發倍受關注，開發新型生物農藥防治草莓灰霉病已成為當前農藥研究與開發領域的熱點之一。拮抗細菌銅綠假單胞菌SU8發酵液和乙蒜素乳油混配防治草莓灰霉病屬于生物防治的范疇，原材料既安全且易得，符合現代農業環保、健康、持續發展的時代要求，值得研究和開發。

大量研究表明，多種植物的活性提取物或微生物菌株的代謝產物可以達到抗灰霉病菌的目的，但大多著重于活性物對灰霉病菌的毒力測定，而對這些活性物質的具體成分確定研究較少。今后應加強活性成分的分離鑒定，探討活性成分的分子結構與構效關系的研究，以期探索出能合成植物源殺菌劑的先導化合物，并研發科學合理的生物劑型，最終應用于農業生產中。本研究明確了SU8發酵液對草莓灰霉病菌的生長有較強的抑制效果，尤其與乙蒜素乳油混配更能提高其抑菌效果。彭雙強等也先后報道了SU8菌株對水稻紋枯病菌、草莓灰霉病菌等多種菌株具有較強的拮抗效果，并且分別采用乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚等溶劑提取SU8的抑菌活性物質，經檢測確定了SU8抑菌類物質為吩嗪類物質[39-41]。吩嗪類物質是一種廣泛存在于假單胞菌代謝產物中的抑制真菌的抗生素，與眾多報道的假單胞生防菌的抑菌活性物質基本相同，故菌株SU8具有作為生防菌的潛力。

在微生物環境中，菌株的拮抗現象屢見不鮮。然而拮抗菌的代謝產物未必對同種微生物有抑制效果。研究發現銅綠假單胞菌SU8發酵液濾液對草莓灰霉病菌具有較強的拮抗效果。本研究利用乙蒜素乳油、SU8發酵液及兩者不同質量比的混合組配防治草莓灰霉病。室內毒力試驗結果表明，混合組配中以質量比為4 ∶1、9 ∶1的增效效果最為明顯，選取2種混合組配開展孢子萌發抑制試驗，并進行盆栽防治試驗。試驗結果均表明，乙蒜素乳油與SU8發酵液混配對草莓灰霉病的防治效果比單一藥劑好。這一結果表明，混配是一條有效防治草莓灰霉病的途徑，也明確了乙蒜素乳油與SU8發酵液2種生防物質的混配比例，但其增效機制、作用方式與劑型開發還有待進一步研究。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.06.020