反相高效液相色譜法測定豆制品中堿性橙2

丁曉靜 張晶 邵兵 趙珊

堿性橙2(chrysoidine)亦稱王金黃、塊黃，CAS:532 －82 －1，分子式 C12H12N4·HCl，相對分子質(zhì)量為248.72。因具有與蛋白結(jié)合牢固的特點(diǎn)而被不法分子用于豆制品染色。《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中明確了豆腐皮中添加王金黃。由于豆制品在大眾的日常飲食中占有較大比重，該物質(zhì)的添加將極大危害人民群眾的健康。因此，建立簡便、快速、準(zhǔn)確的方法檢測該違法添加成分十分必要。高效液相色譜法和高效液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法成為目前檢測非法添加工業(yè)染料的主要方法［1－13］。本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)建立了超高效液相色譜—電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法檢測豆制品中12種禁用工業(yè)染料的篩查確證方法［6］，于2017年3月在該法基礎(chǔ)上，針對著色能力強(qiáng)的堿性橙2開展樣品前處理研究，進(jìn)一步優(yōu)化樣品提取、凈化條件，提高液相色譜法的檢測靈敏度，從而解決實(shí)際樣品中堿性橙2的準(zhǔn)確測定問題。將該法用于實(shí)際樣品的檢測，獲滿意結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑 Waters 2695－996型高效液相色譜儀，配備二極管陣列檢測器。Milli-Elix/RiOs超純水儀(美國Millipore公司);Vortex Genie 2型多用途旋渦混合振蕩器(美國 Scientific Industries公司);08855－02型超聲波清洗儀(美國Cole-Parmer公司);低溫離心機(jī)(美國Beckman公司)。Oasis混合型陽離子交換(MCX)固相萃取柱 (3 mg，6 cc，美國Waters公司);冰乙酸(≥99.8%，北京化學(xué)試劑公司);乙酸銨(分析純，北京化學(xué)試劑公司);甲酸、氨水(優(yōu)級純，北京化工廠)、乙腈、甲醇(色譜純，Dikma科技有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取適量堿性橙2標(biāo)準(zhǔn)品，用少量50%乙腈水溶解，再用乙腈定容，制成1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備液，－18℃以下保存，標(biāo)準(zhǔn)儲備液在12個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)系列工作液:用80%乙腈—水將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0和15.0 mg/L作為工作曲線，臨用時(shí)配制。1.3 陽性腐竹樣品的制備 為了體現(xiàn)與實(shí)際樣品的一致性，本實(shí)驗(yàn)室制備了腐竹陽性樣品，具體方法:將腐竹樣品粉碎、加入適量堿性橙2標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，冷凍干燥、備用。該陽性樣品用于優(yōu)化前處理方法。

1.4 樣品提取 稱取1 g(精確到0.01 g)粉碎的豆制品樣品于50 mL塑料離心管內(nèi)，先加入2.5 mL 0.4%乙酸—20 mmol/L乙酸銨水溶液、混勻，然后再加入10 mL乙腈，渦旋混勻15 s，超聲提取30 min，靜置分層，4 ℃ 9 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL刻度管內(nèi)。殘?jiān)性偌尤?.5 mL溶液混勻、10 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清液。

1.5 樣品濃縮、凈化 MCX固相萃取柱依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，保持柱體濕潤。取經(jīng)冷凍、離心凈化的乙腈提取液10 mL，用200μL甲酸酸化，轉(zhuǎn)移至經(jīng)活化的MCX固相萃取柱，用3 mL甲醇淋洗，然后將MCX柱抽干，用3 mL 5%氨水—甲醇溶液洗脫目標(biāo)化合物，收集洗脫液，35℃氮吹濃縮至近干，用0.5 mL 80%乙腈—水溶液溶解，9 000 r/min離心5 min或過0.22μm聚四氟乙烯濾膜，上機(jī)測定。

1.6 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(5μm，4.6 mm×250 mm);流動相:A，0.4%乙酸－20 mmol/L乙酸銨水溶液;B，乙腈;梯度洗脫，梯度洗脫條件見表1。流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10μL;檢測波長:430 nm。采用二極管陣列檢測器，保留時(shí)間定性的同時(shí)，再比較化合物特征吸收光譜圖定性(表1)。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1 樣品提取條件的選擇: 對于脫水的豆制品如腐竹、豆腐皮等，若直接用乙腈提取，則乙腈不易滲透到樣品組織內(nèi)，而先往這些樣品中加入少量水，可使樣品充分吸水溶脹后再用乙腈提取。在前期研究工作中比較了水—乙腈、水—乙酸—乙腈及水—硫酸銨—乙腈三種溶劑對提取目標(biāo)化合物的提取效率［6］，從結(jié)果來看，水—硫酸銨—乙腈的提取效率相對較低，水—乙腈提取率相對較高，水—乙酸—乙腈的提取率較高，堿性橙2可到達(dá)90%左右。此外，豆制品中蛋白的等電點(diǎn)在pH 4.5左右，選擇水—乙酸—乙腈(0.4%乙酸)作為提取溶劑有利于蛋白沉淀。

2.1.2 樣品濃縮、凈化條件的選擇:為提高檢測靈敏度，樣品提取液需采用MCX柱濃縮、凈化后方能進(jìn)樣測定。分別試驗(yàn)了2%及4%三氯乙酸沉淀蛋白提取堿性橙2，結(jié)果顯示提取率小于10%，由此可見，僅僅采用酸性水溶液不能有效提取豆制品中王金黃;固定提取液中0.4%乙酸含量不變，又分別試驗(yàn)了不同比例的乙腈的提取效果，隨著乙腈含量從30%、50%、60%、70%、80% 的逐步遞增，回收率亦逐漸增加，70%、80%乙腈回收率高于85% ～90%，提取效果最好。故選擇80%乙腈—0.4%乙酸為提取液。保持提取液中80%乙腈含量不變的條件下，對酸度進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，比較不同酸度條件下的提取效果，乙酸由0.4%、0.8%、1.2%到1.6%，隨著酸度的增加，回收率反而降低，可能的原因是當(dāng)酸性增強(qiáng)，堿性橙2分子中的氨基離子化效應(yīng)增強(qiáng)，反而不易被乙腈萃取，而在提取液中加入20 mmol/L乙酸銨，可使帶負(fù)電的乙酸根與帶正電堿性橙2形成離子對，從而有利于乙腈提取。文獻(xiàn)報(bào)道選擇混合型弱陰離子交換柱凈化提取液中的堿性橙2［2］，回收率在90%左右，由于堿性橙2為含氮弱堿性化合物，更適合混合型陽離子交換(MCX)SPE柱凈化，因此，試驗(yàn)了基質(zhì)加標(biāo)樣品過MCX固相萃取柱凈化、濃縮，其過柱回收率為90%左右，在430 nm檢測，無干擾，檢測靈敏度較高。

2.1.3 液相色譜—紫外檢測條件的選擇: 堿性橙2的極性較強(qiáng)，上樣液為80%乙腈—水溶液，乙腈—水溶液分離時(shí)，溶劑化效應(yīng)嚴(yán)重，導(dǎo)致堿性橙2的峰展寬，靈敏度下降，且色譜峰的重現(xiàn)性差。流動相中加入0.4%乙酸—20 mmol/L乙酸銨時(shí)，酸性條件下，堿性橙2帶正電，與乙酸根陰離子可形成離子對，在色譜柱的保留增強(qiáng)，減弱了溶劑化效應(yīng)，峰形改善，靈敏度提高。

2.1.4 檢出限、定量限、線性: 用80%乙腈—水，將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成 0.50、1.0、2.0、5.0、10.0 和15.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以外標(biāo)法定量，線性方程為y=35 800x－333，線性相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9。在樣品基質(zhì)中加入一定量的堿性橙2，按上述條件提取、凈化，HPLC測定，以信號和噪音(S/N)S/N=10的信號所對應(yīng)的量為檢出限，S/N=3的信號所對應(yīng)的量為定量限，分別為0.13 mg/kg和0.4 mg/kg。

2.1.5 回收率和精密度: 分別準(zhǔn)確稱取腐竹空白樣品各6份，每份1 g(精確到0.01 g)，共分3組。堿性橙2的添加水平分別為0.5 mg/kg、5.0 mg/kg和10.0 mg/kg，測得回收率和精密度結(jié)果見表2，腐竹中不同濃度平均加標(biāo)回收率為77.8% ～83.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～3.5%(n=6)。標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白樣品加標(biāo)色譜圖分別見圖1和圖2，紫外吸收光譜圖見圖3。

表2 HPLC測定豆制品中堿性橙2回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

圖1 堿性橙2標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖/10 mg·kg－1

圖2 空白樣品加標(biāo)溶液色譜圖/10mg·kg－1

2.1.6 實(shí)驗(yàn)室間方法驗(yàn)證: 本方法經(jīng)北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評估中心、成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院、遼寧省食品檢驗(yàn)檢測院、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院共5家實(shí)驗(yàn)室對該方法進(jìn)行了協(xié)同驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證樣品基質(zhì)為腐竹，3個(gè)添加濃度水平、每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，均獲得了滿意結(jié)果，充分證明該方法的普遍適用性，易于推廣使用。

圖3 堿性橙2標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外吸收光譜圖

3 結(jié)論

本方法能夠?qū)Χ怪破分袎A性橙2進(jìn)行有效提取，凈化并準(zhǔn)確定量，操作簡便，檢測靈敏度滿足樣品定性、定量的要求，適用于豆制品中堿性橙2的檢測。

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