直腸癌組織中bcl-2及ck-20表達與臨床病理因素的相關性

裴銳鋒，徐 為，楊為彬

（江蘇省徐州市腫瘤醫院，江蘇 徐州 221000）

直腸癌組織中bcl-2及ck-20表達與臨床病理因素的相關性

裴銳鋒，徐 為，楊為彬

（江蘇省徐州市腫瘤醫院，江蘇 徐州 221000）

目的探討直腸癌組織中bcl-2、ck-20的表達及與臨床病理因素相關性關系，分析二者對直腸癌的發生、發展及遠處轉移的影響。方法用免疫組織化學S-P法，檢測bcl-2及ck-20在直腸癌組織、癌旁組織中的表達情況，采用X列表進行x2檢驗及spearman等級相關分析bcl-2及ck-20的表達與患者年齡、性別、腫瘤侵及范圍、腫瘤距肛門距離、病理分型、淋巴結轉移、遠處轉移和臨床分期等各因素之間的關系，數據統計用SPSS11.0統計軟件完成。結果1.53例直腸癌組織中bcl-2陽性表達率54.53%，其中19例（+），10例（++）。11例癌旁組織中2例表達呈陽性，陽性率為18.18%，bcl-2在直腸癌組織中陽性表達率明顯高于癌旁組織中的陽性表達率，其差異有統計學意義（x2=5.2281，P＜0.05）。結論1.直腸癌組織中bcl-2、ck-20表達較癌旁組織明顯增強。2.直腸癌組織中bcl-2、ck-20的表達可作為判斷直腸癌發展、轉移和預后的重要指標。

直腸癌；bcl-2；ck-20；局部淋巴轉移；遠處轉移

直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在歐美所有癌癥致死患者中占8%-10%[1]，近年來也一直呈現上升趨勢。我國直腸癌發病率在10-20/10萬人次。在我國直腸癌患者中以低位直腸癌多見，男性多于女性，年齡多在40-60間。本研究中直腸癌組織中bcl-2、ck-20的表達是經免疫組化法檢查得出，同時分析研究其臨床和病理參數的關系。

1 材料與方法

1.1 標本收集

此次研究選取自1994～2003年期間徐州醫學院附屬醫院病理科直腸癌外科的53例手術石蠟包埋標本，術前無任何治療史，對照組為當中的11例癌組織遠端的正常細胞組織，其中男性33名，女性20名，最大85歲，最小30歲，中位年齡58.7歲；其中高分化14例，中分化25例，低分化14例；其中腺癌48例，2例不典型增生伴癌變，兩例腺癌伴部分粘液細胞癌，1例腺癌伴印戒細胞癌，臨床分期分為，PTis原位癌，限制在上皮基底膜延至粘膜肌層，但粘膜肌層并未被穿破，T1侵入粘膜下層，T2穿入但未完全浸透肌層，T3可以浸透腸壁直至腸壁外軟組織，卻不能浸透漿膜表面及鄰近組織，PT4 a侵潤鄰近器官或組織，T4b侵入壁腹膜伴或不伴鄰近結構浸潤，包括游離穿孔入腹腔者，N中的N0：部分淋巴結未轉移；N1：部分淋巴結發生轉移；M中的M0：遠端淋巴結未發生轉移；M1：遠端淋巴結發生轉移；其中Ⅰ期16例（分期見下圖表1），Ⅱ期19例，Ⅲ期11例，Ⅳ期7例。見表1。

表1 TNM分期

1.2 試劑

兔抗人Bcl-2多克隆抗體、兔抗人ck-20多克隆抗體、免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉生物制劑有限公司。

1.3 試驗使用的設備

日產奧林巴斯的顯微鏡；2）海爾微波爐；3）海爾冰箱；4）恒溫箱設備；5）重慶試驗儀器廠的蒸餾水制作設備。

1.4 方法

1.4.1 染色操作方法

根據設備上的操作說明進行試驗。

（1）使用酒精等試劑對石蠟進行處理并取適量沖洗液進行處理隨后進行切片操作。

（2）進行切片操作時，使用酶對石蠟進行處理，并對實驗操作的環境進行溫度控制，溫度應在25攝氏度左右，等待十分鐘進行孵育。

（3）取用適量的羊血清對做好的切片進行處理，并將樣本放到溫度在37攝氏度左右的環境中進行孵育，持續時間一刻鐘左右，隨后進行多次沖洗處理。

（4）取50微升的生物素試劑，并加入到做好的切片中，每份切片都需要進行標記，將處理好的樣本放置到環境為37攝氏度的環境中進行孵育，持續時間為15～20分鐘，隨后進行多次沖洗處理。

（5）取50微升的酶溶液對做好的切片進行下一步處理，隨后將樣本放置到環境為37攝氏度的環境中進行孵育，持續時間為15～20分鐘，隨后進行多次沖洗處理。

（6）使用蒸餾水設備制作蒸餾水，在做好的切片上滴入顯色液，等待樣本充分反應之后使用制備的蒸餾水進行清洗。

（7）取適量蘇木素對樣本進行染色處理，等待三分鐘后使用制備好的整理水進行清洗。

（8）進行對照分析：按照檢驗結果，切片檢驗反應為陽性，將PBS設置為研究中的空對照，所有染色環節都按照相應的標準進行分析。

1.4.2 評價標準分析

Bcl-2存在于癌細胞細胞核的周圍，并且在細胞質中也有發現，檢驗為陽性的細胞在顯微鏡觀察中呈現為黃色。如果觀測到呈現為陽性的黃色細胞數量占總體的5%以內則為陰性，如果占總體的6%到30%則評定為弱陽性；如果陽性細胞數量超過30%，最多在60%內評定為中陽性；數量超過60%評定為強陽性。CK20定位于細胞質內，陽性細胞呈棕黃色，邊緣處顯著，陰性者無著色。根據陽性表達率分為：陰性，陽性細胞數＜20%；陽性，20%＜陽性細胞數＜60%；陽性細胞數＞60%為強陽性的檢測結果[2]。

1.5 統計學分析

所有試驗過程取得的數據都通過SPSS 20.0計算分析，通過x2對取得的數據進行分析檢驗，如果計算得到P＜0.05表示試驗結果有統計差異，若計算得到P＞0.05則表示雖然存在差異但不顯著。

2 結 果

2.1 直腸癌組織、癌旁正常組織中bcl-2、ck-20表達情況

bcl-2主要表達于核周級胞質，為棕黃色顆粒，見圖片1、2。在53例直腸癌組織中，24例表達陰性，29例表達陽性，陽性率為54.72%，其中（+）19例，（++）3例，（+++）7例。癌旁正常組織中2例表達陽性，見圖3，陽性率18.18%。

圖1 直腸癌組織中bcl-2陽性表達 低倍10×10

圖2 bcl-2主要表達于內質網 高倍10×40

圖3 癌旁組織bcl-2弱陽性表達低倍10×10

bcl-2在直腸癌組織檢測結果中的陽性率較高，超過癌旁的檢測結果，二者存在統計差異，相關統計值計算結果為x2=5.2281，P＜0.05）。見表2。

表2 直腸癌組織、癌旁正常組織bcl-2、ck-20的表達 [n（%）]

ck-20陽性表達為胞質呈棕黃色顆粒，在53例直腸癌組織中23例陰性，30例表達陽性，陽性率為43.40%，其中（+）23例，（++）7例，癌旁正常組織中1例表達陽性，陽性率9.09%，ck-20在直腸癌組的檢測水平大幅超過癌旁的檢驗結果，對比存在統計差異，相關統計數值x2=5.842，P=0.001。見表3。

表3 bcl-2、ck-20表達與局部淋巴轉移、遠處轉移的關系 [n（%）]

2.2 各病理因素與bcl-2、ck-20表達的關系

本文結合bcl-2、ck-20表達分析其與臨床分期、年齡、性別、病理分型、腫瘤部位、腫瘤范圍、是否轉移、手術方式、CEA、P53等的關系。實驗按性別分成女組和男組，按年齡分為大于50歲組和小于50歲組；按照腫瘤距離肛門＜5cm分為一組，距離≥5cm為一組；病理分型分為高、中、低分化；淋巴轉移分為有轉移組和無轉移組；腫瘤侵及范圍分為侵及局限于粘膜層，侵及肌層及侵及漿膜層（全層）；有無遠處轉移分為有遠處轉移組和無遠處轉移組；p53分為表達陽性組和表達陰性組（p53分為陽性數＜5%為陰性，5%-40%為陽性，＞40%為強陽性）；CEA分為表達陽性組和表達陰性組（CEA＜5ng/ml為陰性，＞5ng/ ml為陽性）；手術方式分為Miles術式組，Dixon術式組和其它手術方式組；將其分為兩組，Ⅰ期和Ⅱ期為一組，Ⅲ期和Ⅳ期為一組。

2.3 各病理因素與1bcl-2表達的關系

根據表2數據可知年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤范圍、組織分型、淋巴局部轉移、CEA等每個分組的bcl-2表達差異不明顯P＞0.0，沒有統計學意義，而不同TNM分期、P53和遠處轉移不同組間bcl-2表達有明顯統計學差異（P＜0.05）。

2.3.1 bcl-2表達與TNM分期的關系

35例Ⅰ-Ⅱ期直腸癌組織中bcl-2陽性表達23例，陽性率65.71%；18例Ⅲ-Ⅳ期直腸癌組織中bcl2陽性表達6例，陽性率33.33%。Ⅲ-Ⅳ期組bcl-2陽性率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期組，有統計學意義（x2=8.7690，P＜0.05）。Spsearman等級相關分析得出bcl-2表達水平與TNM分期呈負相關（r=-4908，P＜0.05）。

2.3.2 bcl-2與p53表達的關系

9例p53表達陰性的直腸癌組織中bcl-2陽性表達9例，陽性率100%；44例p53表達陽性的直腸癌組織中bcl-2陽性表達20例，陽性率45.45%。不同水平的p53之間bcl-2表達差異有明面統計學意義（x2=14.5627，P＜0.05）。Spearman等級相關分析得出bcl-2表達與p53水平呈負相關（r=-0.6583，P＜0.05）。

2.3.3 bcl-2與遠處轉移的關系

46例遠處無轉移的直腸癌組織中bcl-2陽性表達為9例，陽性率63.04%，7例有遠處轉移的直腸癌組織中陽性表達0例，陽性率0%。兩組間差異明顯，有統計學意義（x2=9.7455，P＜0.05）。Spearman等級相關分析得出bcl-2表達與遠處轉移呈負相關（r=-0.4，P＜0.05）。

2.4 各病理因素與ck-20表達的關系

根據表2數據可知年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤范圍、組織分型、淋巴局部轉移、CEA等每個分組的ck-20表達差異不明顯P＞0.0，沒有統計學意義；而不同TNM分期、局部淋巴結轉移、p53及遠處轉移不同組間ck-20表達有明顯統計學差異（P＜0.05）。

2.4.1 ck-20與TNM分期的關系

35例Ⅰ-Ⅱ期直腸癌組織中ck-20陽性表達6例，陽性率17.17%，18例Ⅲ-Ⅳ期直腸癌組織中ck-20陽性表達17例，陽性率94.44%。兩組間ck-20表達差異有統計學意義（x2=21.0913，P＜0.05）。Spsearman等級相關分析得出ck-20表達與TNM分期呈正相關（r=0.6307，P＜0.05）。

2.4.2 ck-20與局部淋巴結轉移的關系

35例局部無淋巴轉移的直腸癌組織中ck-20陽性表達7例，陽性率20%，18例有局部淋巴結轉移的直腸癌組織中陽性表達16例，陽性率88.89%。兩個組別ck-20的表達差異明顯，P＜0.05，具備統計學意義。通過Spsearman等級分析可知淋巴局部結轉移與ck-20正相關。

2.5 bcl-2與ck-20在直腸癌組織中的關系

53例直腸癌組織中ck-20表達陰性30例，其中bcl-2陽性表達16例，占53.33%，陰性14例，占46.67%；23例ck-20陽性表達組織中bcl-2陽性表達13例，陽性率56.52%，陰性10例，占43.48%。ck-20不同表達水平間bcl-2表達無明顯統計學意義（x2=0.0535，P＞0.05），Spearman等級相關分析顯示ck-20表達水平與bcl-2無相關。

3 討 論

3.1 bcl-2在直腸癌組織中的表達及臨床意義

目前，bcl-2被認為是抑制凋亡基因，其在18q21.3染色體定位，大概是230kb，在染色體外膜、內質網、核膜上由bcl-2蛋白定位。凋亡的過程是程序化的、多基因調控的，其中bcl-2是凋亡調控的中心環節。本研究采用免疫組化的方法檢測了直腸癌組織、癌旁正常組織中bcl-2的表達情況。試驗結果顯示bcl-2在直腸癌組織中陽性率為54.72%，在癌旁組織中的陽性率為18.18%，癌旁組織的陽性表達率明顯低于直腸癌組織，P＜0.05，差異顯著。這與國內外報道bcl-2在結直腸癌組織中異常表達結論一致[3]。在病理和生理影響下，bcl-2和它的蛋白產物是調節凋亡的重要因素。如果bcl-2表達過度，則抑制凋亡現象[4]。所以，bcl-2可以延長細胞壽命，堆積細胞，發揮其始動作用。有研究表明bcl-2的表達會受到p53的直接影響，而bcl-2可以抑制p53使細胞凋亡，證明bcl-2和p53可以共同調節凋亡細胞[5]。而本次實驗顯示p53和bcl-2是負相關，相一致與以上研究。有研究表明直腸癌和bcl-2表達緊密相關，負相關于Dukes分期，直腸癌晚期可以顯示出bcl-2表達有大量丟失現象[6-7]，此結論在本試驗再次得到論證。

3.2 ck-20在直腸癌組織中的表達及臨床意義

在1990年研究發現，ck-20包括48553個分子量、氨基酸有424個，ck-20為CK酸性、18 kb總長編碼DNA、有5.66等電點、內含子有7個、外顯子有8個。1.75 長kbmRNA。ck20合成后會第一個出現在腸粘膜上皮（第8周胚胎），它主要表達于胃腸道上皮、泌尿道上皮和默克爾細胞[9]，在正常外周血、骨髓和淋巴結檢測不到ck-20[10]，作為觀察大腸癌微轉移的指標，具有一定的特異性[11]，已得到認可[12]。在本試驗中ck-20在直腸癌組織中陽性表達率為43.40%，在癌旁組織中陽性表達率為9.09%，二者存在顯著性差異（P＜0.05）。與其他角蛋白不同的是，ck-20具有局限性，它只定位在胃腸道上皮細胞，所有大腸癌會侵襲、擴散、轉移到別的組織保持穩定。在對轉移的直腸癌檢測中ck-20是良好的標志物[13]。國外研究表明，ck-20在正常組織不表達或極低表達[14]，本試驗結果與上述結論一致。在直腸癌分期方面，本試驗結果Ⅲ-Ⅳ期ck-20陽性表達明顯高于Ⅰ-Ⅱ期（P＜0.05），與孫念緒等[15]研究結論一致。

4 結 論

直腸癌組織中bcl-2、ck-20表達較癌旁正常組織明顯增強。直腸癌組織中bcl-2表達與TNM分期、P53和遠處轉移相關，呈負相關；ck-20表達與TNM分期、局部淋巴結轉移、p53及遠處轉移相關，呈正相關。

直腸癌組織中bcl-2、ck-20表達可以作為判斷直腸癌發展、轉移和預后的重要指標。

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本文編輯：吳玲麗

R735.37

B

ISSN.2095-8242.2017.010.1861.04