養陰清肺湯對肺炎支原體肺炎作用機制的網絡藥理學分析

湯玉梅，任園園，吳振起

1.遼寧中醫藥大學研究生學院，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110032

肺炎支原體肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)是一種以發熱、劇烈干咳以及胃腸道癥狀等為主要臨床表現的呼吸系統疾病[1]。MPP多歸屬于中醫的“咳嗽”、“肺炎喘嗽”等范疇，疾病前期外感風邪,外邪由口鼻或皮毛而入，侵犯肺衛，出現發熱、咳嗽、鼻煽、痰鳴等證候，發為肺炎喘嗽；疾病后期多為氣陰兩虛證[2-3]。MPP 的臨床治療應以清熱化痰、止咳平喘、益氣養陰為主。養陰清肺湯出自《重樓玉鑰》，盛麗先教授取養陰清肺湯滋陰涼潤之功，用于肺炎支原體感染后陰虛內熱咳嗽[4]。養陰清肺湯成分十分復雜，其治療MPP 的作用機制尚未明確。因此，本研究擬利用網絡藥理學方法，探究養陰清肺湯主要藥效物質基礎、核心靶點及信號通路之間的關系，為進一步闡述養陰清肺湯治療MPP的藥理機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 養陰清肺湯活性成分及靶點 將養陰清肺湯全方生地黃、麥冬、牡丹皮、白芍、薄荷、玄參、浙貝母、甘草分別輸入TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction數據庫檢索養陰清肺湯活性成分作用靶點，根據篩選閾值口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18 進行篩選，并利用UniProt數據庫(https：//www.uniprot.org/)將靶蛋白轉換成對應的靶基因。在GeneCards (https：//www.genecards.org/)數據庫以“Mycoplasma pneumoniae pneumonia”為檢索詞，搜索肺炎支原體肺炎靶基因，將肺炎支原體靶基因與養陰清肺湯活性成分靶基因輸入Venny2.1 軟件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，取得兩者交集靶基因作為養陰清肺湯治療肺炎支原體靶基因，將活性成分及其靶點導入Cytoscape3.7.2 軟件，構建活性成分-抗肺炎支原體靶點網絡圖。

1.2 養陰清肺湯活性成分抗MPP 靶點相互作用研究 將篩選得到的活性成分-抗肺炎支原體靶點導入 STRING 平臺(https：//string-db.org/cgi/input.pl)構建靶蛋白互作網絡(protein-protein interaction，PPI)，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，低相互作用閾值為“medium confidence”，其他參數保持默認值。將PPI網絡導入Cytoscape3.7.2軟件，利用“Network Analysis”功能計算蛋白節點的度值(Degree)和介數(Betweenness)2 個重要網絡拓撲參數，選取Degree在平均值之上的靶蛋白作為養陰清肺湯治療肺炎支原體的關鍵靶標。

1.3 養陰清肺湯活性成分抗MPP 靶點基因本體(GO)功能富集京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將養陰清肺湯抗MPP 關鍵靶點輸入Omicshare (https://www.omicshare.com/tools/)云平臺進行GO功能富集分析；利用DAVID數據庫進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路分析，物種與背景設置均為“Homo sapiens”(智人)進行操作(https：//david.ncifcrf.gov/)對關鍵靶點進行KEGG 通路富集分析。依據P＜0.001篩選養陰清肺湯抗MPP靶點富集的生物功能及信號通路，以闡明養陰清肺湯的活性成分對肺炎支原體肺炎靶點具有一定的生物功能，以及在相關信號通路中的起調控作用。

2 結果

圖1 活性成分-MPP靶點韋恩圖

圖2 活性成分-MPP靶點網絡

編號YY1 YY2 YY3 YY4 YY5 YY6成分10-de-oxyeucommiol 6-O-sec-hydroxyaeginetoyl ajugol adenosine coniferin diincarvilone A ferulic acid methyl ester YY7 YY8 YY9 YY10 YY11 YY12 YY13 YY14 YY15 YY16 YY17 YY18靶點PTGER3、EPHX1 MMP9、MMP8、MAPK14 GAPDH、EGFR、PDCD4、MAPK1、HSPA1A TYMP、MMP8 MAPK14、MAPK1、TNF、PARP1、PTGS2、NR3C1、MAPK10、TK1、RET、TKT MMP9、EGFR、PARP1、PTGS2、RET、TLR4、CYP1A2、STAT3、IDO1、ALPL、ELANE、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、BRAF、TLR9、F3 MAPK14、RET、NR3C1、ELANE、PTPN6、HMOX1、FABP5、EPHX1、PTGS2、STAT3 STAT3、VEGFA、CYP2D6、IL2 GSTM1、JUN、NOS2、ABCB1、IL1B、PDCD4、PTGS2 VEGFA NOS2、G6PD、TOP1、ATP12A、PTGER3、TNF、NR3C1、PTPN6、FABP5 PTGER3、TNF、NR3C1、PTPN6、FABP5、NOS2、G6PD、TOP1、ATP12A TYMP MMP9、EGFR、MAPK1、PARP1、TLR4、ALPL PTGS2 PTGS2、CASP3、JUN、TGFB1 ALPL、NOS2 ALPL YY19MAPK1、TNF、PTGS2、RET、BRAF、RXRA YY20TNF、PARP1、RET、ALPL、BRAF、F3、MMP8 YY21 YY22 YY23 YY24 YY25 YY26 YY27 YY28 YY29 YY30 YY31 YY32 YY33 YY34 YY35 YY36 YY37 YY38 YY39 YY40 guanosine rehmaglutin a rehmaglutin c rehmaglutin d rehmaionoside c rehmapicrogenin salidroside trans-p-hydroxy cinnamic acid methyl ester sugiol beta-sitosterol 2'-hydroxymethylophiopogonone a 5,7,2'-trihydroxy-6-methyl-3-(3',4'-methylene-dioxybenzyl)chromone 5,7-dihydroxy-6,8-dime thyl-3-(4'-hydroxy-3'-methoxybenzyl)chroman-4-one 5-hydroxy-7,8-dimethoxy-6-methyl-3-(3',4'-dihydroxybenzyl)chroman-4-one 6-aldehydo-isoophipogonone a 6-aldehydo-isoophipogonone b diosgenin isoophiopogonone a jasmololone methy-lophiopogonone b methyl beta-orcinol caroxylate methyl ophiopogonanone a methyl ophiopogonanone b n-(trans-p-coumaroyl)tyramine n-trans-feruloyltyramine n-[β-hydroxy-β-(4-hydroxyphenyl)]ethyl-4-hydroxy cinnamide ophiopogonanone b ophiopogonanone c ophiopogonanone e ophiopogonanone f ophiopogonone a ophiopogonone b ophiopogonone c orchinol YY41 YY42 YY43 stigmasterol-beta-d-glucoside paeoniflorin kaempferol YY44 YY45(+)-catechin quercetin ALPL、NOS2 ALPL、NOS2、ABCB1、CYP2C9 MAPK14、CYP3A4、IL2、CYP2C9 ALPL、NOS2 MMP9、MAPK14、EGFR、MAPK1、NR3C1、HMOX1、NOS2、IL6、MAP2K1 ALPL、NOS2、ABCB1 MMP9、MMP8 MMP8、MAPK1、PARP1、RET、BRAF、F3 PTGS2、BRAF、F3、RXRA、STAT6 MMP9、MMP8、MAPK14、EGFR、ELANE MMP8、EGFR、TNF、PTGS2、BRAF、TOP1、MAP2K1 MMP9、MMP8、EGFR、MAPK1、TYMP、ALPL、BRAF、VEGFA、TOP1、MAP2K1、HIF1A、TLR9 PTGS2、BRAF、JUN、ABCB1、RXRA PTGS2、ALPL、NOS2 MMP8、TNF、PARP1、BRAF MMP8、TNF、MAPK1、PARP1、BRAF ALPL ALPL、ABCB1、CYP2C9 ALPL、NOS2 MMP9、MAPK14、EGFR、PARP1、RET、STAT3、CYP3A4、BRAF、CYP2D6、IL2、CYP2C9、MAP2K1 STAT3、IL2 TNF、IL6、CD14、LBP TNF、PTGS2、CYP1A2、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、HMOX1、GSTM1、JUN、NOS2、NOS3、ICAM1、SELE、GSTP1、SLPI PTGS2、RXRA PTGER3、MMP9、EGFR、MAPK1、TNF、PARP1、CYP1A2、CYP3A4、CASP3、CYP1A1、F3、HMOX1、VEGFA、IL2、GSTM1、JUN、NOS2、IL1B、TOP1、TGFB1、RXRA、IL6、HIF1A、NOS3、ICAM1、SELE、GSTP1、PLAU、IL10、TP53、ODC1、SOD1、MYC、CCL2、CXCL8、IFNG、PTEN、IL1A、CRP、CD40LG、PTGS2

續表1

續表1

2.1 養陰清肺湯活性成分抗MPP 靶點及其網狀圖 將TCMSP、Swiss Target Prediction 數據庫檢索得到的152 個活性成分對應768 個活性成分靶基因與GeneCards 數據庫挖掘到的274 個肺炎支原體肺炎靶基因交集篩重，得到136個活性成分對應的74個抗肺炎支原體肺炎的靶基因，見圖1。通過Cytoscape3.7.2軟件建立養陰清肺湯136 個活性成分對應74 個靶標的關系網絡，結果見表1、圖2。從方劑-化合物-靶點網絡的總體特征分析發現，136 個活性成分中既存在一個化合物作用于多個蛋白靶點，同時也存在多個化合物與同一個蛋白靶點作用的現象，表明了養陰清肺湯治MPP的多成分、多靶點的作用特點。連接靶標最多的5 個化合物分別是槲皮素、阿魏酸甲酯、木犀草素、山奈酚、鳥苷；與化合物成分連接最多的前10個靶標基因分別是PTGS2、NOS2、MAPK14、RXRA、TNF、EGFR、MAPK1、MMP9、PARP1、TOP1。活性成分-抗肺炎支原體肺炎靶點網絡圖共有211 個節點，682 條邊，每個活性成分均能作用于多個抗肺炎支原體肺炎靶點，體現了養陰清肺湯的多成分、多靶點作用。

2.2 養陰清肺湯活性成分抗MPP靶點的PPI網絡分析 PPI網絡共74個節點，1 023條相互作用連線，平均degree27.65，平均betweenness為9.26×10-3，degree超過平均值的靶點共有35 個，主要包括IL6、TNF、PTGS2、IL10、IL1B、IL4、IL2、ICAM1、IFNG、CRP、NOS2、CD40LG、CXCL8、ELANE、STAT3、TLR4、CCL2、MAPK1、MAPK14、TGFB1、TLR9、FASLG、STAT6 免 疫 炎 癥 因 子 ，VEGFA、HMOX1、NOS3、NR3C1、CASP3 心 血 管 靶 點 ，TP53、JUN、MYC、MMP9 癌基因及 EGFR、GAPDH 等，說明養陰清肺湯作用機制主要與其調節免疫炎癥、心血管生理、抑癌基因、細胞周期及凋亡等密切相關。結果見圖3、表2。

表2 關鍵靶點及其拓撲參數

2.3 養陰清肺湯抗MPP靶點的GO功能富集 根據P＜0.001，共獲取442個GO條目，其中生物過程(biology process)占 408 個，分子功能(molecular function)占22個，細胞組成(cellular componet)占12個。其中生物過程涉及生物過程調節、免疫系統過程、刺激反應、代謝、細胞增殖、發育過程等；分子功能及細胞組成主要涉及催化活性、轉錄調節因子活性、分子傳感器活性、抗氧化活性以及細胞器、細胞膜、突觸等。說明養陰清肺湯可能通過調節免疫系統以及調控細胞增殖、凋亡、代謝等發揮抗MPP的作用，見圖4。

2.4 養陰清肺湯抗MPP 靶點的KEGG 通路 對篩選出的核心靶點進行KEGG 通路富集分析，共獲得 89 條富集通路，其中 P 值＜0.001 的前 30 條通路(圖5)與養陰清肺湯抗MPP 密切相關的有TNF 信號通路、T 細胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、Jak-STAT 信號通路、Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路、NOD 樣受體信號通路等。結果表明，養陰清肺湯抗MPP 主要通過對免疫通路與炎癥通路的影響，進而改善MPP 的臨床癥狀。

圖4 養陰清肺湯抗MPP靶點的GO功能富集

圖5 KEGG信號通路點狀圖

3 討論

養陰清肺湯出自清代著名醫家鄭梅澗所撰《重樓玉鑰》，由生地黃、麥冬、牡丹皮、白芍、薄荷、玄參、浙貝母、甘草八味藥組成。藥用生地甘苦而寒，既能滋腎水救肺燥，又能清熱涼血解疫毒，故重為君藥；麥冬養陰潤肺清熱，玄參清熱解毒散結，兩者共助生地養陰清熱解毒，為臣藥；白芍斂陰和營，丹皮涼血活血，貝母潤肺化痰，薄荷辛涼宣散，共為佐藥；生甘草清熱解毒，調和諸藥。多項研究表明，養陰清肺湯對MPP療效確切。李煒[5]研究發現以養陰清肺湯聯合孟魯司特鈉咀嚼片治療MPP致慢性咳嗽有助于緩解患兒的癥狀體征和減輕炎癥反應。付慧玲[6]研究發現養陰清肺湯聯合阿奇霉素治療兒童肺炎支原體肺炎療效倍增。章紅[7]研究表明養陰清肺湯聯合阿奇霉素治療肺炎支原體肺炎可提高治愈率，縮短病程，減少副作用的發生，具有良好的治療作用。本研究通過網絡藥理學方法，相對全面地探究了養陰清肺湯治MPP可能的分子機制。

本研究基于網絡藥理學方法，明確了養陰清肺湯136種成分74個MPP靶點，并根據PPI網絡分析篩出35個關鍵靶點，發現養陰清肺湯的關鍵靶點主要歸屬于免疫炎癥、心血管生理、抑癌基因、細胞周期及凋亡相關蛋白等。MP可刺激單核巨噬細胞、淋巴細胞等誘導產生IL-1、IL-2、IL-3，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12，IL-18 以及TNF-α等多種細胞因子，其中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等可能與MPP發病機制有關。GO生物過程主要包括生物過程調節、免疫系統過程、刺激反應、代謝、細胞增殖、發育過程等。MPP發病機制雖不明，但這與目前提出的免疫損傷、呼吸道上皮吸附作用、MP細胞毒素學說[8]機制相吻合，說明養陰清肺湯主要通過調節機體免疫功能、代謝、細胞增殖等作用來治療MPP。

本研究通過KEGG富集分析表明與養陰清肺湯治療MPP相關通路主要涉及調節免疫功能、抑制炎癥等通路。免疫損傷是MPP重要的發病機制學說之一，MP的免疫損傷機制包括：體液免疫損傷、細胞免疫損傷、炎癥損傷、抗原免疫損傷和免疫抑制[9]。T細胞亞群相互協調作用的關鍵是維持T淋巴細胞亞群及Th1/Th2機體的免疫平衡，而肺支原體能直接刺激T、B淋巴細胞增殖，同時釋放TNF-α、IFN-γ、IL-1等細胞因子，引起Th1/Th2/Treg 免疫細胞亞群失衡，加重機體的免疫損傷[10]，養陰清肺湯可能作用于T細胞受體調節MPP患者免疫功能。腫瘤壞死因子(TNF)，又稱為TNF-α，它參與全身炎癥反應，是組成急性期反應的細胞因子之一。TNF-α主要由Th1分泌，能增強T細胞、B細胞、NK細胞等的免疫活性[11]。Toll樣受體(TLR)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，研究表明MPP患兒的TLR4水平較高[12]，且TLR2信號通路在肺組織對抗MP感染而產生的天然應答中起關鍵作用[13]。NLRP3為NOD樣受體家族成員，研究發現NLRP3炎癥小體通路參與MPP發病過程，且與病情嚴重程度密切相關。PI3K-Akt信號通路是具有酶活性的細胞內信號轉導通路，體內外實驗研究證實PI3K-Akt信號通路在肺部炎癥反應中發揮著重要的負向調控作用[14]。p38是MAPK信號通路的關鍵因子，p38MAPK被激活后影響轉錄因子的活性，從而調控炎癥反應[15]，實驗研究顯示MP感染后大鼠肺組織的p38MAPK蛋白表達升高[16]。JAK-STAT信號通路是介導炎癥介質過度表達的信號轉導通路之一，實驗表明肺部感染的發生機制與JAK2-STAT3信號轉導通路的活化密切相關[17]。以上可知，養陰清肺湯調節MPP免疫反應可能作用于T細胞受體、TNF、Toll樣受體、NOD樣受體等信號通路，此外養陰清肺湯還可能通過PI3K-Akt、MAPK 以及 JAK2-STAT3 等信號通路發揮抗炎的作用。

綜上所述，本研究利用網絡藥理學的方法獲取養陰清肺湯抗MPP的相關靶點以及通路，發現其可能主要通過調節免疫系統與炎癥系統來改善MPP 的臨床癥狀，但有待通過進一步體內外實驗加以驗證。