從調控TGF-β/Smads通路途徑探討龍葵防治肝癌的機理*

楊旭峰

廣東省深圳市寶安區中心醫院中醫科(深圳 518102)

從調控TGF-β/Smads通路途徑探討龍葵防治肝癌的機理*

楊旭峰

廣東省深圳市寶安區中心醫院中醫科(深圳 518102)

目的：探討龍葵提取物對HepG2細胞增殖、侵襲力和細胞凋亡的影響，闡明龍葵防治肝癌細胞凋亡的機理。方法：選取肝癌患者50例為研究對象，采集其肝癌標本并將處于對數生長期的HepG2細胞分別加入合適濃度的龍葵提取物(龍葵組)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS組)、轉化生長因子-β抑制劑Decorin(TGF-β組)，采用TUNEI法及RT-PCR法檢測凋亡細胞及HepG2細胞中TGF-β、SMAD3、SMAD4基因表達。結果：在抑制HepG2細胞增殖、降低侵襲力以及促進細胞凋亡比較上，龍葵組效果最佳，PBS組最差，TGF-β組居中， 且均P<0.05；三組TGF-β、SMAD3、SMAD4基因表達比較有統計學差異(均P<0.05)。結論：龍葵提取物可通過調控TGF-β/Smads通路來抑制腫瘤細胞增殖和侵襲力、促進細胞凋亡，對于肝癌的治療具有重要意義。

原發性肝癌(Primary liver ancer，PLC)屬于我國發病率較高的惡性腫瘤，高發年齡段集中在40～50歲之間，男性患者數量顯著高于女性[1]。雖然外科手術切除病灶成為提高肝癌患者生存周期的有效手段，但是在臨床中原發性肝癌手術切除率僅在20%左右，絕大多數患者在明確診斷時往往已經處于中晚期，錯過了最佳手術時間窗[2]。盡管隨著醫學技術快速發展，肝動脈化療栓塞術(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)治療中晚期肝癌可取得一定效果，卻不可避免的存在著肝、腎功能損害、機體免疫力下降等問題。大量研究證實，中醫藥在肝癌防治工作中可收獲理想的療效，特別是龍葵具有抗腫瘤活性，可應用于中晚期肝癌的防治，被我國中醫學界列為了十大抗腫瘤中草藥之一并引起了國內外的高度關注[3]。鑒于此，本次研究圍繞從調控TGF-β/Smads通路途徑對龍葵防治肝癌的機理予以深入分析，現報告如下。

資料與方法

1 一般資料 將來自于深圳市寶安區中心醫院2015年5月至2016年5月期間內收治的50例肝癌患者為研究對象，其中男性肝癌患者38例，女性肝癌患者12例；年齡35～65歲，平均年齡(50.25±1.33)歲；病程10個月至2.5年，平均病程(20.25±1.25)個月；臨床分期：Ⅰb 4例，Ⅱa 10例，Ⅱb 19例，Ⅲa 15例，Ⅲb 2例；臨床表現：肝區疼痛37例，全身和消化道癥狀13例。診斷標準:所有肝癌符合中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會頒布的《原發性肝癌診療規范(2015年版)》以下標準：①客觀存在肝硬化以及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)或丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染證據，即：HBV和/或HCV抗原陽性；②在動脈期，多排CT掃描和/或動態對比增強MRI檢查結果顯示有肝臟占位快速不均質血管強化，而在靜脈期或延遲期肝臟占位快速洗脫；③血清AFP持續1個月≥400μg/L 或著持續2個月≥200μg/L，且除外其他原因所致[4]。

2 研究方法

2.1 細胞培養: 在征得患者知情同意下采集其肝癌標本并將處于對數生長期的HepG2細胞接種于培養瓶之中，培養液為DMEM培養液(含10%胎牛血清)，隨后置于37℃培養箱中隔天更換一次培養液，傳代培養[5]。

2.2 龍葵提取物溶液制備: 將干燥的龍葵醇提物溶于DMSO之中并采用Hank’s平衡鹽溶液進行稀釋，此間DMSO的含量<0.05%(v/v)。

2.3 體外試驗: ①HepG2細胞增殖，分別加入合適濃度的龍葵提取物(龍葵組)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS組)、轉化生長因子-β(TGF-β組)抑制劑Decorin藥物溶液，培養48 h后加入MTT溶液培養至52 h，采用酶標測試儀測定其吸光度值[6]。②HepG2細胞侵襲，將經過各種藥物溶液預處理的HepG2細胞加入到Transwell小室的上室，經過培養后去除培養液后固定，HE染色并于顯微鏡下計數，以侵襲細胞的相對數目表示其侵襲能力。③HepG2細胞凋亡，采用TUNEI法測定其凋亡，所有操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2.4 HepG2細胞中TGF-β、SMAD3、SMAD4基因表達的測定:將處于對數生長期的HEPG2細胞種植于6孔板并分別加入包含各組藥物溶液的DMEM完全培養液，培育7 d后采用RT-PCR法測定不同組別HEPG2細胞中TGF-β、SMAD3、SMAD4基因表達含量[7]。

3 觀察指標 ①HepG2細胞增殖、侵襲力和細胞凋亡；②HepG2細胞中TGF-β、SMAD3、SMAD4基因表達。

4 統計學方法 應用SPSS 17.0統計學軟件，采用均數±標準差表示計量資料，進行t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

1 三組對HepG2細胞增殖、侵襲力和細胞凋亡的影響 見表1。在抑制HepG2細胞增殖、降低侵襲力以及促進細胞凋亡比較上，龍葵組效果最佳，PBS組最差，TGF-β組居中，組間差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 三組對HepG2細胞增殖、侵襲力和細胞凋亡的影響(%)

注：與PBS組相比較， *P<0.05；與PBS組、TGF-β組相比較，△P<0.05

2 三組TGF-β、SMAD3、SMAD4基因表達比較 見表2。三組TGF-β、SMAD3、SMAD4基因表達比較，龍葵組優于其他兩組且差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 三組TGF-β、SMAD3、SMAD4基因表達比較

注：與PBS組相比較，*P<0.05；與PBS組、TGF-β組相比較，△P<0.05

討 論

龍葵為一年生直立草本植物，其味苦、性寒、微甘，自身伴有少量毒素，具有清熱解毒、活血散結、利水消腫等功效[8]。由于龍葵中生物堿含量較高，在進入肝癌患者體內后可發揮出阻斷和逆轉肝癌前病變、抑制腫瘤細胞分裂與增殖、誘導癌細胞凋亡、調節機體免疫能力、保護肝腎功能等作用[9-11]。由于目前肝癌發病機制十分復雜，所以肝癌的治療仍然是困擾當前臨床的棘手問題之一。隨著醫學研究的不斷深入開展，通過調控信號通路的手段來遏制肝癌病情的進一步惡化已經成為惡性腫瘤信號轉導領域的一個熱點。在此其中TGFβ/Smads信號通路則是典型的代表。該信號通路由TGFβ超家族、Smad蛋白家族所構成，其中TGFβ家族能夠直接影響腫瘤細胞的增殖與分化，而Smad蛋白家族則是目前已知最早被證實的TGFβ受體激酶的底物，廣泛分布在細胞質之中，可以將信號經由細胞膜傳遞至細胞核，為受體激酶介導的細胞內信號轉導途徑[12]。二者形成的信號通路具有調控靶基因轉錄作用，影響肝癌的發生與發展。

本次研究中通過將龍葵作用在人肝癌細胞HepG2以觀察其對于HepG2細胞增殖、侵襲力和細胞凋亡的影響，結果發現龍葵提取物除了具有抑制HepG2細胞增殖、降低侵襲力以及促進細胞凋亡的功效外，還可以通過調控TGFβ/Smads信號轉導通路，降低TGF-β含量，提高SMAD3、SMAD4基因表達的方式來實現誘導肝癌細胞凋亡，從而為肝癌的臨床治療提供了全新的作用靶點以及藥物選擇，進一步拓寬了中醫藥防治包括肝癌在內的惡性腫瘤的思路。

[1] 徐文洋，吳若云，魯玉輝.基于TGF-β1/Smad信號通路探討加味茵芍散含藥血清對大鼠肝星狀細胞增殖作用的影響及機制[J].世界中西醫結合雜志，2016，10(5):630-635.

[2] 梁逸強，周 莉，周 端，等.參蛤散對心室重構大鼠TGF-β1/Smads信號傳導的影響[J].遼寧中醫雜志，2014，21(10):2232-2236.

[3] 王秋虹，林 蘭.中藥對細胞外信號調節激酶信號轉導通路的調節[J].吉林中醫藥，2015，15(3):289-293.

[4] 李 建，黨曉偉，董振花，等.TGF-β1、Smad2、CyclinD1與惡性腫瘤關系的研究進展[J].臨床和實驗醫學雜志，2015，10(2):164-167.

[5] 滑 振，龐立健，趙仲雪，等.中醫藥防治肺纖維化實驗研究不同信號轉導通路研究概述[J].遼寧中醫藥大學學報，2015，17(8):64-67.

[6] 湯志杰，張茂娜，陳 莉.肝癌和肝纖維化發生EMT及相關信號通路的分子機制[J].實用癌癥雜志，2014，11(1):113-116.

[7] 劉 璽，鄭 勇，陳衛剛.TGF-β/SMADS通路及其Smad4基因在胃癌中的研究現狀[J].醫學綜述，2013，25(21):3841-3843.

[8] 李瀚旻，趙賓賓，高 翔，等.“補腎生髓成肝”改善肝再生微環境、防治肝癌的作用及機制[J].湖北中醫藥大學學報，2015，21(1):5-8.

[9] 田 青,唐啟盛,趙瑞珍,等. 抑郁癥模型大鼠皮質、海馬cAMP通路的信號表達及頤腦解郁方的干預作用[J].中國實驗方劑學雜志, 2012，18(3)：121-124.

[10] Amber A，Bokhari,Viqar Syed. Inhibition of transforming growth factor‐β (TGF‐β) signaling by scutellaria baicalensis and fritillaria cirrhosa extracts in endometrial cancer[J]. J Cell Biochem,2015,116(8):1230-1235.

[11] 李 海.解毒祛瘀論治原發性肝癌的臨床研究[J]. 陜西中醫，2016，37(1)： 60-61.

[12] 廖 琦.晚期肝癌患者疼痛及生存質量調查研究[J].陜西醫學雜志，2016，45(7)： 925-92.

(收稿：2016-12-08)

Mechanism of Solanum nigrum in the prevention and treatment of liver cancer from the regulation of TGF-β/Smads pathway

Yang Xufeng.

Department of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen Bao’an Central Hospital(Shenzhen 518102)

Objective:To investigate the effects of solanum nigrum extract on HepG2 cell proliferation,invasion and apoptosis,to clarify the mechanism of solanum nigrum in the prevention and treatment of liver cancer cells apoptosis.Methods:50 cases of patients with liver cancer as the research object,collected liver cancer specimens and HepG2 cells in the exponential growth phase were added to solanum nigrum extract of the appropriate concentration(solanum nigrum group),phosphate buffered saline(PBS group),transforming growth factor beta inhibitors(TGF-β group),TUNEI method and RT-PCR method were used to detect the expression of TGF-β,SMAD3 and SMAD4 in apoptotic cells and HepG2 cells.Results:In inhibiting HepG2 cell proliferation, reducing the invasiveness and promoting cell apoptosis,the effects of solanum nigrum group was the best,the worst in PBS group,TGF-β group was center,P<0.05.Compared the expression of TGF-β,SMAD3 and SMAD4 genes in the three groups,P<0.05.Conclusion:Solanum nigrum extract can regulate TGF-β/Smads pathway to inhibit proliferation and invasion of tumor cells,promote cell apoptosis,plays an important role in the treatment of liver cancer.

Liver neoplasms/ traditional Chinese medicine therapy Solanum nigrum/ therapeutic uses Transforming growth factor beta @Smads pathway

*廣東省深圳市寶安區衛生公益性科研項目(2015127)

肝腫瘤/中醫藥療法 龍葵/治療應用 轉化生長因子-β @Smads通路

R614

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.05.002