扶正解毒法對肺炎模型大鼠的p38MAPK信號通路調(diào)控及抗氧化應激作用*

李美鳳，祁海燕，封繼宏△，魏葆琳

1．天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院(天津 300150)，2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

扶正解毒法對肺炎模型大鼠的p38MAPK信號通路調(diào)控及抗氧化應激作用*

李美鳳1，祁海燕2，封繼宏1△，魏葆琳1

1．天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院(天津 300150)，2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003)

目的：觀察扶正解毒中藥對肺炎模型大鼠p38MAPK信號通路的調(diào)控及抗氧化應激作用。方法：將60只雄性Wistar大鼠隨機分為6組，分別為空白對照組、模型組、扶正中藥組、解毒中藥組、扶正解毒中藥組和抗生素干預組，除空白組外均采用氣管內(nèi)滴注肺炎鏈球菌建立肺炎大鼠模型，然后空白組及模型組給予生理鹽水灌服，各干預組對應給予藥物治療，共7 d，分別于第4天、第8天取材，采用生化法檢測大鼠血清SOD、MDA、MPO、LPO含量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA )檢測大鼠血清TNF-α含量，采用免疫印跡法檢測肺組織p38MAPK表達情況。結(jié)果：模型組大鼠血清中MDA、MPO、LPO、TNF-α均較空白組升高(P<0.05)，各藥物干預組與模型組相比，上述四種細胞因子水平均下降(P<0.05)；模型大鼠血清中SOD較空白組下降(P<0.05)，各藥物干預組與模型組相比，表達含量均有所升高(P<0.05)；模型組大鼠肺組織P38MAPK表達較空白組升高(P<0.05)，各藥物干預組與模型組相比較，P38MAPK表達水平均下降(P<0.05)。結(jié)論：扶正解毒中藥可以通過調(diào)控p38MAPK信號通路下調(diào)炎癥因子的表達及促進抗氧化應激，以減輕自由基等過氧化物對機體的損傷，減輕肺部氣道炎癥應答反應，從而對機體起到保護作用。

社區(qū)獲得性肺炎(Community acquired pneumonia，CAP)是由細菌、病毒、非典型病原體等引起的、發(fā)生在肺實質(zhì)的炎癥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肺炎進展過程中存在以“肺脾氣虛”為主的正虛及“痰、熱、瘀”為主的邪實，認為其治療應扶正祛邪，制定了扶正解毒、清熱化瘀治則，研制出扶正解毒方。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合扶正解毒中藥可以明顯改善患者臨床癥狀，縮短患者退熱時間及住院天數(shù)[1]。本文旨在探討扶正解毒方對肺炎鏈球菌所致肺炎模型大鼠p38MAPK信號通路的調(diào)控與抗氧化應激的作用。

材料與方法

1 動 物 選用清潔級雄性Wistar大白鼠60只，平均體重180g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)1周進行造模。

2 造模用細菌 大鼠造模選用肺炎鏈球菌標準菌株(菌株號：ATC49619)，實驗開始前制備成 1.2×109cfu/ml 菌懸液(注：標準菌株來自于天津市臨檢中心)。

3 藥 品

3.1 西藥：頭孢呋辛酯片,規(guī)格: 250mg/片(生產(chǎn)批號 H20080328);生產(chǎn)廠家：葛蘭素史克(Glaxo Operations UK Limited)。

3.2 中藥處方：扶正解毒中藥,黨參、黃芩、魚腥草、赤芍、紫菀、冬瓜子、甘草；扶正中藥：黨參、甘草；解毒中藥：黃芩、魚腥草、赤芍、紫菀、冬瓜子。

實驗所用藥物均于天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科購買，為保證藥物轉(zhuǎn)換量精確，將所用中藥制備為提取物，最終折合比例為1 g提取物相當于生藥3.19 g，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4 試劑盒 超氧化物歧化酶SOD試劑盒、丙二醛MDA試劑盒、髓過氧化物酶MPO試劑盒、脂質(zhì)過氧化物酶LPO試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

大鼠腫瘤壞死因子TNF-αELISA試劑盒、大鼠抗人磷酸化-p38MAPK抗體由購于華美公司。

5 動物模型構(gòu)建 采用課題組自創(chuàng)的內(nèi)窺鏡引導下氣管內(nèi)滴注肺炎鏈球菌菌懸液的方式構(gòu)建肺炎動物模型[2]。

6 分組及給藥

6.1 分組：將大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為空白組、模型組、扶正中藥組、解毒中藥組、扶正解毒中藥組、抗生素干預組。

6.2 給藥：各實驗組大鼠在造模結(jié)束后第 2 天開始進行實驗給藥；空白對照組：生理鹽水灌胃；模型組：生理鹽水灌胃；扶正中藥組：灌服扶正中藥提取物水溶液，每鼠 0.63 g/(kg·d)；解毒中藥組：灌服解毒中藥提取物水溶液，每鼠 4.58 g/(kg·d)；扶正解毒中藥組：灌服扶正解毒中藥物水溶液，每鼠 5.2 g/(kg·d)；抗生素組：灌服頭孢呋辛酯水溶液，每鼠50 mg/(kg·d)；1次/ d，給藥時間持續(xù)7 d，每組動物分別于治療后第 4天和第8天取材。

7 觀察指標

7.1 血清SOD、MDA、MPO、LPO、TNF-α測定，打開腹腔，腹主動脈取血2 ml，3 000r/m離心10 min，分離血清，-80℃分裝保存。SOD、MDA、MPO、LPO采用生化法， TNF-α采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，操作均根據(jù)試劑盒進行。

7.2 開胸取肺組織，用于p38MAPK檢測，采用免疫印跡法(West blot)檢測。

8 統(tǒng)計學方法 選用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件，實驗結(jié)果采用均數(shù)±標準差或四分衛(wèi)間距形式表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較行ANOVA，方差不齊時采用非參數(shù)檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

整個實驗過程中，模型組死亡2只，解毒中藥組死亡1只，其余各組大鼠例數(shù)未發(fā)生變化。

1 大鼠血清SOD、MDA、MPO、LPO表達 模型組大鼠血清中MDA、MPO、LPO均較空白組升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；各藥物干預組與模型組相比，三細胞因子水平均下降，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。模型大鼠血清中SOD較空白組下降，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；各藥物干預組與模型組相比，表達均升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清SOD、MDA、MPO、LPO結(jié)果

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

2 大鼠血清腫瘤壞死因子TNF-α表達 模型組大鼠血清中TNF-α較空白組升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；各藥物干預組與模型組相比，三細胞因子水平均下降，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表2。

3 大鼠肺組織p38MAPK蛋白表達 模型組大鼠肺組織P38MAPK表達較空白組升高，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；各藥物干預組與模型組相比，P38MAPK表達水平均下降，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，見表3。

表2 各組大鼠血清TNF-α結(jié)果比較(ng/L)

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05

表3 各組大鼠肺組織P38MAPK表達比較

注：與空白組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與扶正解毒中藥組相比，&P<0.05

肺炎模型大鼠血清、肺組織中存在炎癥因子表達異常及氧化應激，扶正解毒中藥可以降低炎癥因子的表達、減輕氧化應激，進而減輕機體損傷。

討 論

現(xiàn)代研究[5]證實MAPK通路能被多種生物活性物質(zhì)(如各種氧化應激中間產(chǎn)物、炎癥因子等)激活，調(diào)控著炎癥的發(fā)生和發(fā)展；p38MAPK是MAPK家族重要組成成員，扮演著轉(zhuǎn)導樞紐的角色，參與了多種細胞信號(如氧化應激、炎癥反應等)的傳導，其蛋白磷酸化水平增強是MAPK通路激活的標志，其可以促進炎癥因子的表達，亦可激活一氧化氮合成酶(iNOS)基因轉(zhuǎn)錄、編碼大量蛋白，進而產(chǎn)生大量NO，誘發(fā)炎癥瀑布。徐蕾等人[3]發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌Spsp A誘導人類單核細胞分泌細胞因子和趨化因子受ERK和p38MARK 途徑調(diào)控。吳盈盈等[4]發(fā)現(xiàn)HSP40誘導小鼠巨噬細胞產(chǎn)生免疫應答受JNK及p38MAPK信號通路調(diào)控。

氧化應激是指在內(nèi)外環(huán)境有害刺激的條件下，機體產(chǎn)生大量高活性分子，例如活性氮自由基、活性氧自由基，超出機體對其清除的能力，氧化-抗氧化失衡，導致大量中性粒細胞(Polymorphonuclear leukocytes，PMN)浸潤，促使過多氧化中間產(chǎn)物生成，推動了氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展，對機體造成損害[6]。活性氧簇ROS、丙二醛MDA、超氧化物歧化酶SOD是評價氧化-抗氧化系統(tǒng)的重要指標，作為脂質(zhì)氧化終產(chǎn)物的丙二醛為評估機體氧化損傷程度提供了重要依據(jù)，SOD幫助清除氧自由基，用來評價機體的抗氧化能力。楊小瓊[7]等人通過研究發(fā)現(xiàn)肺炎的過程中存在氧化應激，并且參與了細胞DNA 損傷，對肺炎的發(fā)生發(fā)展起了一定的作用。另有研究[8]顯示MAPK可以被氧化應激狀態(tài)下產(chǎn)生的大量ROS誘導活化。

本課題組根據(jù)中醫(yī)理論和長期臨床實踐，提出肺炎“因虛致病”的理論，認為肺炎初期及疾病進展過程中都存在正虛，以肺脾虧虛為主；細菌、病毒及非典型病原體等毒邪乘虛而入侵犯機體，正邪相爭而發(fā)熱，熱壅血瘀、氣機阻滯致使病情加重。認為肺炎治療需扶正祛邪相結(jié)合，健脾益氣而扶正，清熱解毒以祛邪。因此制定了扶正解毒、清熱化瘀治則，尊“參蘇飲”、“千金葦莖湯”化裁而出扶正解毒方，其主要組成為黨參、黃芩、魚腥草、虎杖、赤芍、白及、冬瓜子、紫菀和甘草。方中黨參健脾益肺，黃芩、魚腥草清熱解毒，虎杖、赤芍清熱散瘀，白及、冬瓜子逐瘀排膿兼通腑泄熱，紫菀化痰止咳，甘草調(diào)和諸藥，健脾補肺扶助正氣，通腑泄熱調(diào)暢氣機，散瘀解毒祛邪外出。

本研究結(jié)果顯示，肺炎模型大鼠炎癥因子及自由基(TNF-α、MDA、MPO、LPO、p38MAPK)均明顯升高，抗氧化能力(SOD)明顯下降，給予藥物干預后，發(fā)現(xiàn)扶正解毒中藥及抗生素兩組效果較明顯。表明扶正解毒中藥可以通過抑制前炎癥因子的釋放和氧化應激過度爆發(fā)，進而抑制p38MAPK磷酸化，抑制下游炎癥因子的表達，減少對機體的炎癥損傷，以對機體起到保護作用。

[1] 封繼宏.基于“真實世界”的社區(qū)獲得性肺炎中醫(yī)證治初探研究[D].天津：天津中醫(yī)藥大學, 2013.

[2] 封繼宏,祁海燕,鄭兆曄,等. 經(jīng)硬式鼻腔鏡氣管內(nèi)滴注化學制劑建立AECOPD動物模型[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報, 2015, 17(11): 68-70.

[3] 徐 蕾,陳小琴.MAPK 通路對肺炎鏈球菌表面蛋白A促人類單核細胞分泌細胞因子的影響[J].免疫學雜志,2014,30(2):139 -146．

[4] 吳盈盈,高 松,馬 峰,等.肺炎鏈球菌熱休克蛋白40 通過p38MAPK 和JNK通路誘導小鼠巨噬細胞免疫應答[J].細胞與分子免疫學雜志, 2015, 31(6): 730-735.

[5] 張 奇,白曉東,付小兵. p38MAPK信號通路研究進展[J]. 感染、炎癥、修復, 2005, 6(2):121-123.

[6] 楊 明,李國平.氧化應激激活的信號傳導與支氣管哮喘的研究進展[J].重慶醫(yī)學,2014,43(7) : 875.

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[8] Sun Z, Huang Z, Zhang DD. Phosphorylation of Nrf2 at multiple sites by MAP kinases has a limited contribution in modulating the Nrf2-dependent antioxidant response[J]. PLoS One, 2009, 4(8): e6588.

(收稿：2017-01-11)

*國家自然科學基金資助項目(81373849)

肺炎, 肺炎球菌性/中醫(yī)藥療法 扶正解毒法 @TNF-α @p38MAPK

R563.1

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.05.059

天津市科技計劃項目(15ZXLCSY00020)

△通訊作者