NLRP3炎性體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究

宋先東　李揚　劉波　　閆昭威　朱敏

[摘要] 目的 探討NLRP3炎性體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性。 方法 選取2015年1～12月我院收治的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者（RA）40例為研究組，同時選取同期健康體檢人員40例為對照組，比較兩組研究對象外周血NLRP3、半胱天冬酶-1（CASP1）以及凋亡斑點樣蛋白（PYCARD）mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果 研究組的NLRP3表達(dá)顯著低于對照組，同時CASP1以及PYCARD表達(dá)顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 NLRP3炎性體各個基因mRNA表達(dá)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者當(dāng)中表達(dá)異常，表明NLRP3炎性體在炎癥反應(yīng)中有重要影響。

[關(guān)鍵詞] NLRP3炎性體；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；自身免疫性疾病；相關(guān)性

[中圖分類號] R593.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）11-0008-03

Study on the correlation between NLRP3 inflammasome and rheumatoid arthritis

SONG Xiandong1 LI Yang2 LIU Bo1 YAN Zhaowei1 ZHU Min3

1.Department of Second Orthopedics， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China； 2.Department of First Orthopedics， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China； 3.Department of Radiology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between NLRP3 inflammasome and rheumatoid arthritis. Methods Forty patients with rheumatoid arthritis（RA） admitted in our hospital from January to December 2015 were chosen as study group. 40 healthy subjects in the same period were selected as the control group. The mRNA expression levels of NLRP3， caspase-1（CASP1） and apoptotic spot-like protein（PYCARD） in peripheral blood between the two groups were compared. Results The expression of NLRP3 in the study group was significantly lower than that in the control group， and the expressions of CASP1 and PYCARD were significantly higher than those of the control group（P<0.05）. Conclusion The mRNA expression of each NLRP3 inflammasome gene in rheumatoid arthritis is abnormal， indicating that NLRP3 inflammasome has important effect in inflammatory response.

[Key words] NLRP3 inflammasome； Rheumatoid arthritis； Autoimmune diseases； Relevance

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）屬于自身免疫性疾病的一種，臨床表現(xiàn)主要是關(guān)節(jié)滑膜炎癥，關(guān)節(jié)出現(xiàn)對稱性破壞，能夠?qū)е禄颊哧P(guān)節(jié)軟骨以及關(guān)節(jié)囊破壞，嚴(yán)重情況下會使患者的關(guān)節(jié)功能喪失甚至殘毀畸形[1]。該病的發(fā)病機制還不夠明確，研究發(fā)現(xiàn)疾病發(fā)生發(fā)展的過程涉及到免疫反應(yīng)及各種細(xì)胞因子的參與。本研究分析NLRP3炎性體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2015年1～12月我院收治的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者40例為研究組，男32例，女8例，年齡45～69歲，平均（58.1±2.6）歲。所有患者符合類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時排除合并有心血管疾病以及嚴(yán)重肝腎功能障礙的患者。同時選取同期健康體檢人員40例為對照組，男31例，女9例，年齡41～72歲，平均（57.1±1.9）歲。研究對象均未出現(xiàn)實驗室指標(biāo)異常，同時無糖尿病、心血管疾病以及自身免疫疾病。兩組患者的一般資料有可比性（P>0.05），均知情同意本研究，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與合成 抽取患者的外周靜脈血3 mL，使用肝素鈉進(jìn)行抗凝，應(yīng)用人淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，然后應(yīng)用Trizol試劑，根據(jù)說明書提取RNA，添加RNA酶水進(jìn)行溶解[2]。取5 mL RNA樣品進(jìn)行糖凝膠電泳，在糖凝膠圖譜中顯示18S、28S以及5S條帶。紫外分光光度檢測RNA在280 nm 以及260 nm波長位置的吸光度（A）值，計算A260/A280比值。cDNA的合成根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑的操作說明進(jìn)行[3]。

1.2.2 NLRP3、CASP1以及PYCARD基因檢測 應(yīng)用對照組以及研究組的cDNA建立30 μL的反應(yīng)體系，實現(xiàn)PCR擴(kuò)增，在-10℃條件下保存，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用1%糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用曝光機曝光拍攝PCR條帶圖像，應(yīng)用軟件測定灰度值，采用灰度值比表示mRNA的表達(dá)[4]。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的純化以及測序 PCR產(chǎn)物在經(jīng)過凝膠電泳純化后，回收目的片段，將回收的目的基因再次凝膠電泳分析，核實存在條帶后測定目的基因片段的核酸序列[5]。

1.2.4 NLRP3、CASP1以及PYCARD檢測 收集兩組研究對象外周血PBMCs，裂解60 min后，3000 r/min持續(xù)離心20 min并且收集上清。使用BCA法檢測蛋白濃度，使用濃縮膠50 V以及分離膠80 V電泳，按照預(yù)染指示轉(zhuǎn)移蛋白，使用脫脂牛奶進(jìn)行封閉。封閉后用NLRP3、CASP1以及PYCARD抗體孵育過夜，使用TBST洗滌3次，10 min/次。孵育過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 1∶10000，使用曝光機化學(xué)曝光后應(yīng)用軟件測定灰度位[6]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料采用（x±s）表示，組間對比應(yīng)用方差分析及t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

研究組的NLRP3表達(dá)顯著低于對照組，同時CASP1以及PYCARD表達(dá)顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

NLRP3炎性體是在細(xì)胞胞漿中廣泛存在的一種多蛋白復(fù)合物，活化后能夠激活CASP1，從而誘導(dǎo)IL-13以及IL-18等分泌，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展[7]。研究顯示NLRP3炎性體在CASP1以及類風(fēng)濕等炎性疾病發(fā)展中有重要影響[8]。NLRP3炎性體活化后能夠使無活性的CASP1轉(zhuǎn)化為擁有生物活性的CASP1，其中CASP1能夠?qū)L-18等細(xì)胞因子進(jìn)行切割，從而通過活性形式分泌[9]。NLRP3炎性體最早在CASP中發(fā)現(xiàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)其在其他疾病中也有重要的影響，尤其是自身炎癥性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[10]。NLRP3炎性體中的基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期活動狀況、遺傳易感性還有藥物治療應(yīng)答均有密切關(guān)系。與此同時，NLRP3炎性體中的基因是否含有同RA存在聯(lián)系的基因多態(tài)性，還需要后續(xù)的深入研究。相關(guān)研究結(jié)果顯示，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的NLRP3炎性體表達(dá)以及多態(tài)性與患者進(jìn)行英夫利昔治療的應(yīng)答存在密切聯(lián)系，同時發(fā)現(xiàn)NLRP3以及CARD8部分基因位點的多態(tài)性與患者易感性聯(lián)系的證據(jù)[11]。

本研究結(jié)果顯示，NLRP3炎性體中的NLRP3 mRNA表達(dá)在研究組明顯下降（P<0.05），同時PYCARD mRNA表達(dá)在研究組顯著上升（P<0.05），CASP1 mRNA表達(dá)同樣在研究組患者顯著上升（P<0.05），表明類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者NLRP3基因mRNA表達(dá)在炎癥過程中有負(fù)性調(diào)控的效果，特別是在患者非急性期有更為突出的表現(xiàn)[12]。PYCARD及CASP1基因的mRNA表達(dá)則在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者炎癥進(jìn)展中發(fā)揮協(xié)同影響。有研究通過檢測NLRP3炎性體，結(jié)果顯示研究組患者中的NLRP3蛋白表達(dá)以及CASP1蛋白表達(dá)均顯著下降，提示NLRP3的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)比較一致，表明NLRP3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的炎癥進(jìn)展中有負(fù)性調(diào)控影響，同時CASP1基因的mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)結(jié)果相反，具體機制還需要后續(xù)深入研究[13]。有研究人員發(fā)現(xiàn)PYCARD的蛋白表達(dá)明顯上升，表明PYCARD所影響的NLRP3炎性體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的炎癥反應(yīng)中有重要的作用[14，15]。

綜上所述，研究NLRP3炎性體在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)及關(guān)聯(lián)因子特點的改變，對診斷患者的病情、評估患者的預(yù)后質(zhì)量均有重要的應(yīng)用價值[16-20]。不過當(dāng)前情況下，NLRP3炎性體方面的研究仍然處于初步發(fā)展的階段，后續(xù)需要深入研究NLRP3炎性體相關(guān)功能。

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（收稿日期：2017-01-25）