彌漫性大B細胞淋巴瘤Bcl—2蛋白與血管新生關系的研究

陳寶伶

[摘要] 目的 探討彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）Bcl-2蛋白的表達，血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和微血管密度（microvessel density，MVD）的相關性，研究彌漫性大B細胞淋巴瘤Bcl-2蛋白與血管新生的關系。 方法 采用免疫組織化學染色方法（EnVison）檢測彌漫性大B細胞淋巴瘤患者和對照組淋巴結組織中VEGF、Bcl-2、MVD表達情況。 結果 彌漫性大B細胞淋巴瘤患者Bcl-2蛋白、MVD、VEGF 陽性表達均明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.01）。對三者進行兩兩相關性分析，結果顯示MVD與VEGF表達呈正相關，Bcl-2蛋白陽性表達與VEGF表達呈正相關，Bcl-2蛋白陽性表達與MVD表達呈正相關。 結論 VEGF的高表達可以促進腫瘤細胞增殖能力及侵襲能力，可促進Bcl-2蛋白高表達，同時加上本身促血管生成的作用，可降低彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞凋亡，從而增加彌漫性大B細胞淋巴瘤的惡性程度，既而增加了彌漫性大B細胞淋巴瘤的治療難度。

[關鍵詞] 彌漫性大B細胞淋巴瘤；血管內皮生長因子；血管新生；B細胞淋巴因子2蛋白；免疫組織化學

[中圖分類號] R733.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）36-0032-05

[Abstract] Objectives To investigate the relationship among the expression of Bcl-2 protein， VEGF and MVD and discuss the relationship between angiogenesis and Bcl-2 in diffuse large B cell lymphoma. Methods Immunohistochemical assay（EnVison） was performed to test the VEGF， Bcl-2 and microvessel density in diffuse large B cell lymphoma and control group. Results The expression of Bcl-2， MVD and VEGF in diffuse large B cell lymphoma was significantly higher than control group （P<0.01）. VEGF expression was correlated with MVD in diffuse large B cell lymphoma. Bcl-2 expression was correlated with VEGF in diffuse large B cell lymphoma， Bcl-2 expression was correlated with MVD in diffuse large B cell lymphoma. Conclusion High expression of VEGF can improve the proliferation and invasion ability of tumor cell. VEGF can improve the expression of Bcl-2， lower diffuse large B cell lymphoma cell′s death， and increase malignant extent of diffuse large B cell lymphoma， VEGF plays an important role in angiogenesis， then can increase angiogenesis and remedial difficulty of diffuse large B cell lymphoma.

[Key words] Diffuse large B cell lymphoma； Vascular endothelial growth factor（VEGF）； Angiogenesis； B cell lymphoma 2 protein； Immunohistochemical assay

彌漫性大B細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常見的一類侵襲性淋巴瘤[1]。目前發現在淋巴瘤、骨髓瘤及急性白血病等患者的骨髓中存在不同程度的血管新生（Angiogenesis），血管新生可能參與了腫瘤的發生及發展過程[2]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管新生中最主要的調控因子，可誘導大部分惡性腫瘤的血管新生，刺激腫瘤細胞的生長[3]。B細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。在細胞凋亡過程中及腫瘤多重耐藥形成中均起著重要的作用。

隨著對彌漫性大B細胞淋巴瘤研究的深入發展，目前對其病理診斷、治療和殘留病灶的診斷評價等諸多方面均有了較大的發展，但仍有部分患者療效較差，因此為了更好地預測患者在治療過程中病情的發展及制定個體化治療方案，本文應用免疫組織化學技術回顧性分析彌漫性大B細胞淋巴瘤血管新生與Bcl-2蛋白的表達及其之間的聯系，為臨床上對彌漫性大B細胞淋巴瘤的診斷治療及預后提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為2009年9月～2014年9月我院患者淋巴結標本經病理組織學明確診斷的初治的彌漫性大B細胞淋巴瘤患者35例，診斷標準參照WHO（2008）關于造血與淋巴組織腫瘤分類[4]進行，男18例，女17例，年齡12～67歲，平均45歲。原發灶均位于淋巴結內，以頸部為主。納入標準：①符合彌漫性大B細胞淋巴瘤的診斷標準；②取材良好，無污染；③淋巴結蠟塊完整，可重復切片；④切片后應用免疫組織化學染色方法染色效果好的淋巴結組織樣本。排除標準：①不符合彌漫性大B細胞淋巴瘤的診斷標準（例如非霍奇金淋巴瘤分型）；②取材差，淋巴結組織少；③淋巴結蠟塊不完整，不能切片或切片后，貼片不理想。④染色效果差，免疫組化過程中出現掉片、脫片。

在同一時間段收集35例良性淋巴結反應性增生的患者淋巴結標本作對照觀察（因反復咳嗽，頸部包塊疼痛等原因就診的患者），男17例，女18例，年齡14～69歲，平均44歲。納入標準：①因反復咳嗽，頸部包塊疼痛等原因就診的患者，經淋巴結涂片病理活檢不符合彌漫性大B細胞淋巴瘤的淋巴結；②取材良好，無污染；③淋巴結蠟塊完整，可重復切片；④切片后應用免疫組織化學染色方法染色效果好的淋巴結組織樣本。排除標準：因有文獻報道腎素血管緊張素系統的表達可促進血管新生，可能與VEGF生成水平有關，故對照組所有患者排除以下情況：①排除高血壓、糖尿病、心力衰竭、嚴重的肝腎疾病等與腎素血管緊張素（RAS）有關的疾病，無浮腫、脫水。②排除服用ACEI（血管緊張素轉換酶抑制劑）、ARB（血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑）類藥或停用1周以內的患者，服用可能影響RAS藥物（兩性霉素B、β受體阻滯劑）的患者；②取材差，淋巴結組織少；③淋巴結蠟塊不完整，不能切片或切片后，貼片不理想。④染色效果差，免疫組化過程中出現掉片，脫片。

全部標本均為常規用10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋的歸檔蠟塊。連續4 μm切片，分別行免疫組化染色。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 兔抗人VEGF多克隆抗體；PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒；兔抗人FⅢ因子多克隆抗體；鼠抗人Bcl-2單克隆抗體，均購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 免疫組化染色方法 ①石蠟切片至水，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。②進行高壓熱修復抗原，20 min后冷卻至室溫。③3% H2O2室溫避光孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性，PBS沖洗，2 min×3次。④分別滴加適量的兔抗人VEGF多克隆抗體、兔抗人FⅧ因子多克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體工作液，37℃孵育2 h，PBS沖洗，2 min×3次。⑤滴加聚合酶輔助劑于37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。⑥滴加辣根酶標記羊抗兔多聚體試劑于37℃孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次。⑦PBS沖洗，2 min×3次。⑧加DAB顯色劑顯色；⑨自來水充分沖洗、蘇木精襯染、脫水透明、中性樹脂封片。均以胞漿內出現明顯的棕黃色細顆粒為陽性判斷標準。設0.01 mmol/LPBS代替一抗作為陰性對照；省略一抗為空白對照。

1.3 結果判定標準

VEGF、Bcl-2陽性染色定位于細胞漿，大多呈彌漫分布，呈棕黃色顆粒，隨機選擇10個高倍視野，取其平均值計算陽性細胞數。FⅧ因子的染色結果用于計數微血管密度（microvessel density，MVD）。以微血管計數代表血管新生，先用低倍（×100）鏡觀察，尋找微血管最多的熱點區域，然后用高倍鏡（×400）計數5個視野，求其平均值作為MVD。微血管可為單個或一簇棕色的細胞，可有或無管腔。凡血管直徑大于8個紅細胞或血管壁帶有明顯肌層及纖維硬化，炎癥及壞死區的微血管均不能計入總數[5]。

1.4 統計學分析

所有資料均用SPSS19.0 for windows統計學軟件包進行統計分析。計量資料組間比較采用t 檢驗，計數資料采用χ2檢驗，Bcl-2、微血管密度與血管內皮生長因子表達采用直線相關分析，即Pearson法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 彌漫性大B細胞淋巴瘤組與對照組Bcl-2、VEGF及MVD陽性率的測定

2.1.1 Bcl-2蛋白陽性率測定 Bcl-2蛋白表達于細胞漿，呈棕黃色顆粒。彌漫性大B細胞淋巴瘤組為（78.88±4.15）%，對照組為（14.52±3.43）%，彌漫性大B細胞淋巴瘤組明顯高于對照組（P<0.01），見封三圖1～4。

2.1.2 VEGF陽性率的測定 VEGF表達于細胞漿，呈棕黃色顆粒。彌漫性大B細胞淋巴瘤組為（56.88±3.15）%，對照組為（11.53±2.03）%，彌漫性大B細胞淋巴瘤組明顯高于對照組（P<0.01），見封三圖5～8。

2.1.3 MVD的測定 在免疫組織化學的結果中，可見淋巴結中微血管內皮細胞胞漿被染成棕黃色，多數血管具有明顯的管腔， 部分為無管腔的內皮細胞團塊和單個內皮細胞。MVD 結果顯示，彌漫性大B細胞淋巴瘤組為（20.83±4.37）/×400倍視野，對照組為（5.84±1.25）/×400倍視野，彌漫性大B細胞淋巴瘤組明顯高于對照組（P<0.01），見封三圖9～12。

2.2 Bcl-2 陽性率測定、MVD、VEGF含量相關比較

在彌漫性大B細胞淋巴瘤組，MVD與VEGF呈正相關（r=0.745，P<0.01），Bcl-2蛋白陽性率與VEGF呈正相關（r=0.762，P<0.01），Bcl-2 蛋白陽性率與 MVD 呈正相關（r=0.831，P<0.01）。

2.3免疫組化結果

3 討論

彌漫性大B細胞淋巴瘤占臨床所有B細胞淋巴瘤的50%左右，占成人非霍奇金淋巴瘤（non Hodgkin's lymphomas，NHL）的30%～40%，是NHL中最常見的一個類型[6，7]。它的治療歷經了幾十年的轉變，從單一放療到目前的放、化療相結合方案，但部分患兒治療后緩解情況仍不理想。因此尋找合適的標志物進行合理分析和預后評估，對臨床治療加以指導，具有重要意義。

彌漫性大B細胞淋巴瘤在臨床表現、組織形態、預后等多方面有很大異質性及侵襲性，屬中、高度惡性腫瘤[8]。彌漫性大B細胞淋巴瘤可見于各個不同年齡階段，具有隨年齡的增長而發病率逐漸升高的趨勢，研究結果發現男性略高于女性。DLBCL可以是原發，也可以是由其他類型的侵襲性淋巴瘤如邊緣區淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤（follicular lymphomas，FLs）或白血病（如慢性淋巴細胞性白血病）轉化而來[9]。DLBCL是以無痛性、進行性淋巴結腫大（最常見為頸部淋巴結、鎖骨上淋巴結和腋窩淋巴結）為首要臨床表現，當我們發現癥狀后，有些已經到了晚期，例如發生于胸、腹腔臟器（肝臟、脾臟、胃腸道、甲狀腺、扁桃體等）的腫大淋巴結壓迫臟器而出現聲音嘶啞、吞咽困難、呼吸困難等相應癥狀時，晚期患者還可出現發熱、乏力、盜汗、消瘦等全身癥狀。該型淋巴瘤臨床表現復雜多樣，病情進展迅速且缺乏規律，同時容易發生遠處轉移，故預后較差[10]。

目前研究結果表明Bcl-2蛋白在臨床分期和免疫類型中可以獨立作為彌漫性大B細胞淋巴瘤預后因子[11-12]。Bcl-2基因是一種原癌基因，能抑制細胞凋亡。Bcl-2蛋白是Bcl-2致癌基因的產物，它既參與抑制細胞凋亡，也參與細胞增生的調控過程，是重要的細胞凋亡基因及調節蛋白，對于延長細胞壽命起重要作用。本實驗研究顯示Bcl-2陽性表達顯著高于對照組。進一步證實了基因的紊亂在DLBCL的發病中起重要作用。Bcl-2基因在腫瘤中可過度表達，從而抑制細胞凋亡，改變腫瘤細胞的生物學行為，Bcl-2抑制細胞凋亡可能與以下幾個方面有關：①Bcl-2蛋白可抑制內質網管中Ca2+的釋放，使細胞內Ca2+濃度升高，從而抑制凋亡[13]；②H2O2在Bcl-2半胱氨酸氧化作用中作為一個潛在的因素直接調節細胞凋亡[14]；也有學者認為Bcl-2可通過抗氧化劑或抑制氧自由基的產生而發揮其抑制細胞凋亡的功能[15]；③Bax系Bcl-2家族中最具代表性的促細胞凋亡蛋白，當細胞中Bcl-2增多時，則易與Bax形成異源二聚體，從而抑制細胞凋亡，Bax可對Bcl-2表達進行調節，其表達水平增加可拮抗Bcl-2的作用，促進細胞凋亡[16]，相反則抑制細胞凋亡；④目前研究發現Bcl-2半胱氨酸可通過ERK信號對體外細胞的凋亡進行調節，在免疫沉淀作用和共聚焦顯微鏡下發現Bcl-2與胞外信號調節激酶ERK1/2形成Bcl-2-ERK復合物而抑制細胞凋亡，這種相互作用是由Bcl-2半胱氨酸調節的。但因在DLBCL的分型中表達情況不同，故DLBCL患者可出現不同的臨床表現，從而在發現Bcl-2基因異常表達時，可提示Bcl-2基因表達可以用來作為DLBCL的不良臨床過程、療效差的指標。同樣國外大量研究顯示，MYC和Bcl-2高表達，提示彌漫性大B細胞淋巴瘤患者預后較差[17-18]。

腫瘤的發生需要血管形成，血管形成在腫瘤生長、浸潤及轉移方面均起著重要的作用。而腫瘤血管的新生是一個十分復雜的過程，Sharma S等[19]指出MVD最重要的價值在于能夠反映一些實體腫瘤和血液系統惡性腫瘤的生長、轉移和侵襲，并且是預測腫瘤復發和生存的一個重要指標。目前用來判斷預測 DLBCL緩解情況的結果表明DLBCL與新生血管之間存在密切的關系。血管新生在腫瘤的發病過程中起重要作用。但卻是一個涉及多種細胞多種分子的復雜過程。血管新生存在多種的病理生理過程，在惡性腫瘤的生長、浸潤、轉移過程中起重要作用。腫瘤的侵襲播散與細胞外基質的降解和腫瘤的血管生成密切相關。本實驗也發現DLBCL患者的淋巴結病理組織切片中腫瘤細胞均大量增多，病理切片中有核細胞數及微血管數增生活躍，盡管增生程度有所不同，但均高于對照組。血管新生受多種因子調控，其中功能最強、特異性最高的是血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），它能夠促進內皮細胞分裂、增殖和血管構建、遷移，增加血管通透性[20]。除決定腫瘤血管生成外，VEGF還具有一定的免疫調節功能，能夠降低機體內的免疫監視功能，從而促進免疫逃逸[21，22]。研究[23]證實：高度惡性的腫瘤細胞中多存在VEGF高表達和自分泌機制，即腫瘤組織分泌VEGF，而VEGF又通過促進腫瘤組織新生血管的生成，加速腫瘤生長。結內惡性淋巴瘤的部分研究[24]顯示了惡性淋巴瘤細胞中VEGF對推測預后有意義。但目前PGI-DLBCL與VEGF相關性的研究較少。鏡下觀察結果顯示：VEGF既表達于腫瘤細胞，也表達于其周圍組織，說明腫瘤及其周圍細胞均能分泌VEGF[25]，考慮隨著腫瘤生長活躍，腫瘤內血管顯著增生，血管新生腫瘤細胞的營養和物質代謝依賴于微血管，而MVD是反映血管增生及代謝活躍的重要指標。本研究應用免疫組化技術，并用FⅧ因子標記血管內皮細胞，對MVD進行了分析，結果發現彌漫性大B細胞淋巴瘤組均明顯高于對照組，而且VEGF和MVD存在正相關，這與國內外多數學者報道相一致，表明血管新生在彌漫性大B細胞淋巴瘤發生過程中具有重要作用，血管新生程度高，則疾病進展快，預后相對較差，與繼往研究[26]結果相仿。以上結果表明DLBCL與新生血管之間存在密切關系，本研究發現，彌漫性大B細胞淋巴瘤患者Bcl-2蛋白、MVD、VEGF 陽性表達均明顯高于對照組，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）。且結果MVD與VEGF表達呈正相關，Bcl-2蛋白陽性表達與VEGF表達呈正相關，Bcl-2蛋白陽性表達與MVD表達呈正相關。通過對這三者進行兩兩相關性分析，臨床中我們也發現在治療Bcl-2陽性的DLBCL患者時，化療后病情會反復，考慮應給予更加強烈的化療方案，以取得更高的緩解率。Pidgeon CP等[27]發現，VEGF的表達促進了癌細胞中Bcl-2的高表達，而抗VEGF抗體抑制了Bcl-2的高表達，從而抑制腫瘤的生長，促進了腫瘤細胞的凋亡。在彌漫性大B細胞淋巴瘤中，VEGF的高表達可以促進腫瘤細胞增殖能力及侵襲能力，VEGF的高表達，可促進Bcl-2蛋白高表達，同時加上本身促血管生成的作用，可降低彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞凋亡，從而增加彌漫性大B細胞淋巴瘤的惡性程度，既而增加了彌漫性大B細胞淋巴瘤的治療難度。

綜上所述，本研究認為，在彌漫性大B細胞淋巴瘤的不同分型中，促血管新生的調節因子的分泌水平不同，但發現淋巴瘤中仍有較多血管新生，因本實驗樣本含量少，尚有待于更多的樣本去研究。

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（收稿日期：2016-08-23）