大黃芒硝散外敷治療大鼠闌尾周圍膿腫的實驗研究

沈建良+++潘良明++孔祥東++吳鳴+++袁紹峰

[摘要] 目的 探討大黃芒硝散對闌尾周圍膿腫的干預效果，評估其臨床應用價值。方法 選擇SD大鼠（n=36）隨機分為假手術組、給藥組、對照組，每組12只，其中給藥組和對照組通過盲腸結扎穿孔術制備闌尾周圍膿腫模型，假手術組僅開腹翻動盲腸。給藥組在右下腹涂抹大黃芒硝散5 g治療，隔天給藥；對照組涂抹凡士林，假手術組術后不予處理。對動物的體溫、體重和白細胞數量等進行觀察，檢測血漿中炎癥因子白介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。對病區組織標本HE染色大體評估各組局部組織炎癥反應的強度和變化趨勢，通過免疫組化和TUNEL實驗進一步檢測組織中炎癥因子的分泌量及組織發生凋亡的程度。結果 各組動物的體溫及體重之間差別無統計學差異（P > 0.05）；白細胞數量和TNF-α水平均是以對照組升高最明顯，其次為給藥組（P < 0.05）；而IL-1β在各組動物的變化不顯著（P > 0.05）；HE染色、免疫組化及TUNEL實驗結果顯示對照組出現小腸壁增厚，炎癥細胞浸潤和TNF-α分泌量增加以及組織凋亡水平增強的表現，而應用大黃芒硝散干預后，上述表現均得到一定緩解。結論 大黃芒硝散用于闌尾周圍膿腫的治療可在一定程度上緩解炎癥、消除腫脹，具有較好的臨床應用價值。

[關鍵詞] 大黃芒硝散；闌尾周圍膿腫；炎癥反應；組織凋亡

[中圖分類號]R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0151-04

[Abstract] Objective To explore the intervention effect of rhubarb-mirabilite ointment on periappendiceal abscess and evaluate its clinical application value. Methods SD （Sprague Dawley） rats （n=36）were randomly divided into 3 groups： sham operation group， drug group and control group. The drug group and the control group were employed to periappendiceal abscess animal model by cecal ligation and puncture （CLP），while animals in sham operation group were only turned the cecum without CLP. The drug group were treated with rhubarb-mirabilite ointment （5 g） on the right ventral surface of the skin. The control group were treated with vaseline using the same method of delivery. While the sham operation group would not be treated after surgery. Firstly， the general indicators， such as body temperature， wight and white blood cells， were observed. And then the inflammation cytokine IL-1β and TNF-α was detected by ELISA. Further， local samples were collected in which the degree and variation trend of inflammation reaction was observed through the HE staining. And then immunohistochemical staining and TUNEL assay were also carried out to examine the secretion level of TNF-α and the degree of apoptosis in the local tissues of different groups. Results Body temperature and the weight of animals showed no significant change among different groups（P > 0.05）. It was showed that the levels of white blood cells and TNF-α were the highest in the control group， while rhubarb-mirabilite could appropriately block the rise of these two indicators （P < 0.05）. Besides， IL-1β didn't have obvious changes in each group （P > 0.05）. Further， the results of HE staining， immunohistochemical staining and TUNEL assay indicated that significantly thickened small intestinal wall， increased inflammatory cells infiltration and TNF-α secretion and enhanced apoptosis level were observed in control group， however， these indicators could be effectively relieved in rhubarb-mirabilite ointment treated group. Conclusion rhubarb-mirabilite ointment possessed a certain effect of easing inflammation and relieving swelling in periappendiceal abscess. It has good clinical application value.

[Key words] Rhubarb-mirabilite ointment； Periappendiceal abscess； Inflammation reaction； Apoptosis

急性闌尾炎是最常見的急腹癥，其在人的一生中的發病風險為7%～8%[1]。所有急性闌尾炎的患者中有7%的人會形成闌尾周圍膿腫[2]。闌尾周圍膿腫的形成對手術切除闌尾造成一定的困難，可能增加手術并發癥[3]，因此，闌尾周圍膿腫的保守治療已被外科專家所認可[4]。

西醫保守治療主要選用抗生素治療，但當膿腫壁形成后，即使有較高的血藥濃度，對膿腫內的細菌作用也較為有限[5]，因此輔以中藥散劑局部外敷能進一步改善闌尾膿腫的預后[6]。現代臨床經驗證實大黃芒硝散外敷具有消炎止痛， 預防感染， 促進膿腫吸收等功效，在緩解腹痛腹脹、防治腹腔炎性包塊及假性囊腫形成等方面具有一定療效[7]。因此，本研究以中醫學理論為指導，采用經典的盲腸結扎穿孔術制備闌尾周圍膿腫模型[8]，并以大黃芒硝散行局部外敷治療，檢測其對闌尾周圍膿腫的治療效果，為中西醫結合治療闌尾周圍膿腫提供有力的實驗證據。

1 材料與方法

1.1動物

選用4月齡SPF級SD大鼠36只，購自西普爾-必凱公司，合格證號：SCXK（滬）2013-0016，體重（220±30）g，實驗鼠術前適應性喂養1周，喂養條件：溫度在18～26℃，相對濕度40%～70%，噪音85 dB以下，氨濃度20×10-6以下.通風換氣8～12次/h。術前12 h禁食不禁水，實驗時稱重。本動物實驗經動物倫理委員會的批準備案。

1.2儀器和試劑

DY20K電子天平（上海丙林電子科技有限公司）；DT-8806H 紅外電子體溫計（深圳華盛昌機械實業有限公司）；全自動血液分析儀（日本SYSMEX公司）；Universal32R Hettich低溫高速離心機（德國Hettich科學儀器公司）； Leica DM 4000B光鏡顯微鏡（德國萊卡公司）； OLYMPUS BX53倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； TNF-α和IL-1βELISA試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）； TNF-α一抗（美國abcam公司）；TNF-α二抗，DAB（福建邁新公司）；TUNEL試劑盒（瑞士羅氏公司）。

1.3 動物造模

盲腸結扎穿孔術制成闌尾周圍膿腫大鼠模型參考相關文獻[8]。具體方法為將大鼠盲腸根部結扎，用18號針穿通3次，擠出少量腸內容物，固定于周圍小腸造成包裹，術后3 d內腹部觸及包塊或超聲提示膿腫形成即為造模成功。假手術組只開腹、翻動腸道，但無盲腸結扎和穿孔，其余操作與模型組相同。

1.4 藥物

取生大黃和芒硝各50 g，研磨后加入少量凡士林及適量開水制備成藥膏，即用即配。

1.5 方法

動物編號后采用隨機數字表法隨機分為三組（n=12）：A組為假手術組，術后正常飼養，不予干預措施；B組為給藥組，術后在大鼠右下腹涂抹大黃芒硝散，每只用量約5 g，隔天1次；C組為對照組，術后在大鼠右下腹凡士林，隔天1次。

1.6 觀察指標

術后3、6、9 d對各組大鼠的體重和體溫進行監測。處死動物后，對血液中的白細胞數量等進行觀察，并檢測血漿中炎癥因子白介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。通過對病區組織標本HE染色大體評估各組局部組織炎癥反應的強度和變化趨勢，而后通過免疫組化和TUNEL實驗進一步檢測組織中炎癥因子的分泌量及組織發生凋亡的程度。

1.7 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行統計學處理，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，三組間各時間點比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，最小顯著性差異法檢測，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體溫和體重

各組動物體溫未出現明顯的波動變化，平均體溫維持37.5℃左右（圖1A）。對照組和給藥組相較假手術組體重增長速度慢，但整體差異無統計學意義（P > 0.05）（圖1B）。

2.2 血液白細胞數量

術后3 d，對照組白細胞數量略升高，給藥組白細胞數量未發生變化；至術后6 d，可見對照組和給藥組白細胞數量明顯增高，且對照組程度更高，但對比無顯著性差異（P > 0.05）；至術后9 d時，給藥組白細胞數量基本維持在術后6 d的水平，而對照組白細胞數量進一步增高，并與給藥組和假手術組之間差異有高度統計學意義（P < 0.01）（圖2）。

2.3 血漿炎癥因子IL-1β和TNF-α水平

造模后IL-1β在各組動物各時間點的變化不顯著（圖3A，P > 0.05）；而TNF-α在不同組則出現不同的變化趨勢，表現為：①假手術組在術后3 d時呈現TNF-α的輕度升高，而至術后6 d和9 d時則回落至一個較低且穩定的水平；②對照組中TNF-α則一直維持在較高的水平，且均高于假手術組；③雖然給藥組TNF-α的水平也有升高，但程度在各時間點均低于對照組，含量較為恒定且有回落的趨勢（圖3B，P < 0.05或0.01）。

2.4 病區小腸的組織學觀察

由HE染色結果（圖4）可見，假手術組腸壁及小腸絨毛均未見明顯的炎癥反應；對照組腸壁及小腸絨毛在術后3 d時明顯增厚，充滿浸潤的炎性細胞，炎性反應的表現隨著時間延長逐漸加重；給藥組在術后3 d時表現與對照組類似，但其浸潤的炎性細胞少于對照組，且隨著時間的延長，到手術6 d和9 d時可見增厚的腸壁及小腸絨毛逐漸變薄，炎癥細胞逐漸消退，炎癥反應出現了一定程度的緩解。

2.5 小腸組織TNF-α的免疫組化檢測

通過免疫組化對術后6 d和9 d病區小腸組織內TNF-α的表達量進行了檢測，結果顯示假手術組組織內幾乎無TNF-α的分泌，而對照組和給藥組內均可見到TNF-α的陽性表達，且對照組明顯高于給藥組。見圖5。

2.6 小腸組織的凋亡水平檢測（TUNEL法）

小腸組織的凋亡水平檢測（TUNEL法）結果可見假手術組6 d和9 d時組織內熒光強度較弱，發生凋亡的細胞較少；而對照組和給藥組的腸壁和小腸絨毛內則可見大量陽性表現的細胞（綠色點狀熒光，注：黑白印刷中為白色點狀），且對照組明顯多于給藥組。見圖6。

3討論

關于闌尾周圍膿腫的治療是先行抗生素保守治療再行手術干預[9-10]還是發病后立行手術干預[11-12]一直存在爭議。為此，有學者在由穿孔導致的闌尾周圍膿腫中對兩種方案進行對比，認為這類患者先予保守治療，而后再行闌尾切除，預后更好，其分析原因為：降低并發癥的發生，縮短手術時間，降低患者住院時間[9-10]。因此認為，術前的抗生素干預是治療闌尾周圍膿腫的關鍵，但是如果膿腫壁形成，抗生素無法充分發揮作用，而導致相關癥狀無法有效緩解[13]。

中醫認為：腸癰（闌尾周圍膿腫）是因飲食不節，損傷脾胃，濕熱內蘊；或飽食后急劇奔走，腸道運化失司等原因“醞而成膿”[14]。在演變過程中，正邪相爭決定著熱毒的局限與擴展、吸收與蔓延。大黃芒硝散中大黃有活血祛瘀、消熱解毒、消腫止痛等功效，現代研究證實其具有促進腸道蠕動、加速腸道細菌和內毒素的排出、廣譜抗菌及抑制過氧化損傷的作用[15]；而芒硝主要含含水硫酸鈉（Na2SO4·10H2O）具有消除腸癰腫痛、腹滿脹痛等作用。

為了探尋有效的闌尾周圍膿腫干預措施，在本研究中將大黃芒硝散局部外敷于造模區域，通過體內試驗對其效果進行評估。體溫和體重監測中，各組動物的體溫均保持穩定，這可能與大鼠良好的體溫調節能力有關，造模組部分動物體重在術后6、9 d出現較明顯的下降，則可能是由腸道粘連，蠕動功能障礙而引起食欲下降導致。通過對白細胞、IL-1β和TNF-α水平的分析發現，大黃芒硝散外敷雖然不能消除全身炎癥反應，但對其具有一定緩解作用。通過組織標本的局部檢測分析，觀察到類似的表現，具體為：相較對照組而言，大黃芒硝散干預后可有助于緩解小腸壁和小腸絨毛的炎性反應，如可使腫脹的腸壁變薄、浸潤的炎癥細胞減少以及TNF-α分泌水平的下降等。由于造模方式的原因，發生組織凋亡不可避免，而在TUNEL實驗的結果進行分析時發現給藥組發生組織凋亡的程度低于對照組，這說明大黃芒硝具有一定延緩缺血缺氧腸壁組織凋亡的作用。

綜上所述，大黃芒硝散雖然不能完全消除闌尾周圍膿腫的腫脹和炎癥，但可在一定程度上緩解上述癥狀，若將其與抗生素聯用，可彌補抗生素治療的不足，進一步改善闌尾周圍膿腫的預后，具有很好的臨床應用價值。

[參考文獻]

[1] Stewart B， Khanduri P， McCord C， et al. Global disease burden of conditions requiring emergency surgery[J]. Br J Surg，2014，101（1）：e9-22.

[2] Andersson RE，Petzold MG.Nonsurgical treatment of appendiceal abscess or phlegmon：a systematic review and meta-analysis[J].Ann Surg，2007，246（246）：741-748.

[3] 唐雄榮，于慶生，王景祥.中西結合治療闌尾膿腫遠期隨訪[J].中國中西結合外科雜志，1995，2（2）：93-95.

[4] 劉金剛，余云.闌尾膿腫 508例診治分析[J].中國實用外科雜志，1994，14（5）：291-293.

[5] 汪志平，徐良志.彩超引導下穿刺引流加抗生素灌洗保留術治療闌尾周圍膿腫83例[J].臨床軍醫雜志，2013，41（3）：249.

[6] 羅淑紅，謝雪華.中藥外敷治療闌尾周圍膿腫61例[J]. 中醫外治雜志，2013，22（4）：38.

[7] 徐雪芬，朱燕萍，潘芬華，等.大黃芒硝外敷結合中藥灌腸治療盆腔炎性包塊療效觀察[J].浙江中醫藥大學學報，2010，34（2）：247-248.

[8] 黃鑫，張敏州. 盲腸結扎穿孔術-膿毒癥模型研究的金標準[J]. 醫學綜述，2015，21（3）：392-395.

[9] Ein SH，Langer JC，Daneman A. Nonoperative management of pediatric ruptured appendix with inflammatory mass or abscess： presence of an appendicolith predicts recurrent appendicitis[J]. J Pediatr Surg，2005，40（0）：1612-1615.

[10] Zhang HL，Bai YZ，Zhou X.Nonoperative management of appendiceal phlegmon or abscess with an appendicolith in children[J]. J Gastrointest Surg，2013，17（4）：766-770.

[11] Puapong D，Lee SL，Haigh PI. Routine interval appendectomy in children is not indicated[J]. J Pediatr Surg，2007，42（9）：1500-1503.

[12] 張建輝.保守治療和早期手術干預在闌尾周圍膿腫的臨床效果對比分析[J].中國衛生標準管理，2016，7（6）：61-62.

[13] Guida E，Pederiva F，Grazia MD，et al. Perforated appendix with abscess： Immediate or interval appendectomy？ Some examples to explain our choice[J]. Int J Surg Case Rep，2015，40（12）：15-18.

[14] 王振，王潤春，劉桂榮. 張志遠辨證論治消化系統疾病[J]. 實用中醫內科雜志，2016，30（8）：6-7.

[15] 呂賓.中醫藥在重度急性胰腺炎治療中的應用[J]. 中華消化雜志，2013，33（11）：743-745.

（收稿日期：2017-01-12 本文編輯：王 麗）