血紅素氧合酶-1在七氟醚后處理心肌缺血再灌注損傷保護中的作用

李 翔 ，范志強，王建剛，田首元，金弋喬，楊 春，段 俊

· 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

血紅素氧合酶-1在七氟醚后處理心肌缺血再灌注損傷保護中的作用

李 翔1，范志強2，王建剛3，田首元3，金弋喬1，楊 春1，段 俊2

目的 研究七氟醚后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，探討血紅素氧合酶-1(HO-1)的發(fā)揮作用。方法 健康雄性SD大鼠30只，體重230 g ～260 g，采用隨機數(shù)字標(biāo)示法分為5組，每組6只。假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、七氟醚后處理組(SP組)、七氟醚后處理加用鋅原卟啉(ZnPP)組(SP+Zn組)、鋅原卟啉組(Zn組)。S組絲線穿過冠狀動脈前降支(LAD)不結(jié)扎，I/R組、SP組、SP+Zn組、Zn組結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線并再灌注120 min。I/R組、Zn組再灌注前3 min分別單次股靜脈注射生理鹽水1 mL，Znpp(5 μg/kg)稀釋液1 mL并吸入純氧3 min；SP組、SP+Zn組再灌注前3 min分別單次注射生理鹽水1 mL，ZnPP(5 μg/Kg)稀釋液1 mL并吸入2%七氟醚3 min。再灌注滿120 min后，①取抽取動脈血用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測血清肌鈣蛋白(cTn-I)含量。②取心尖缺血組織測超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。③用蛋白印跡法(Western-blot)測心尖缺血組織中HO-1含量。結(jié)果 與S組相比，其余各組cTn-I、HO-1、MDA含量均明顯升高，SOD活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與I/R組比較，SP組cTn-I、MDA含量明顯下降，HO-1含量、SOD活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；I/R組、SP+Zn組、Zn組兩兩比較cTn-I、HO-1、MDA含量和SOD活性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 HO-1在七氟醚后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護機制中起關(guān)鍵作用。

心肌缺血再灌注損傷；七氟醚；缺血后處理；血紅素氧合酶-1

心肌缺血再灌注損傷(myocardium ischemic reperfusion injury，MIRI)防治的研究一直是醫(yī)學(xué)熱點。七氟醚是新型吸入麻醉藥，具有誘導(dǎo)迅速及蘇醒快而完全，血流動力學(xué)穩(wěn)定，廣泛用于臨床麻醉。已證實，七氟醚對MIRI預(yù)處理和后處理均對心肌缺血再灌注損傷有保護作用[1-4]。而七氟醚后處理因為操作更加安全、簡便，避免了缺血后處理要求短暫反復(fù)缺血-再灌注的潛在風(fēng)險和醫(yī)學(xué)倫理道德的限制，更具有可行性，也更適合臨床應(yīng)用[5]。

人類細胞經(jīng)過進化，具有多種抗氧化應(yīng)激的保護機制，其中血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)就是重要的保護機制之一，HO-1能將前氧化物血紅素降解為一氧化碳(CO)、膽綠素(會進一步被降解為膽紅素)和二價鐵[6]。通過降解前氧化物血紅素而產(chǎn)生抗氧化物膽紅素，HO-1 可以保護細胞免受氧化損傷。但七氟醚后處理對心肌的保護是否通過HO-1的表達發(fā)揮作用，目前研究尚罕見，值得進一步探討。故本課題擬通過建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，探討七氟醚后處理是否能通過影響心肌細胞HO-1表達，從而發(fā)揮對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組 健康雄性SD大鼠30只，體重230 g～260 g，許可證編號[SCXK-20140013]，采用隨機數(shù)字標(biāo)示法分為5組，每組6只。假手術(shù)組(S組)、心肌缺血再灌注損傷組(I/R組)、七氟醚后處理組(SP組)、七氟醚后處理+ZnPP組(SP+Zn組)及ZnPP組(Zn組)。

1.2 動物造模 實驗前12 h禁食，腹腔注射20%烏拉坦5 mL/kg麻醉下，仰臥位固定于恒溫動物解剖臺上，針狀電極插入左前肢、右前肢和右后肢皮下，連續(xù)監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中切開，氣管插管后連接動物呼吸機行機械通氣，潮氣量(2～4) mL/kg，通氣頻率(70～80)次/min，吸呼比維持在1∶3。左側(cè)第4肋間開胸，剪開心包，暴露心臟，于左冠狀動脈前降支(LAD)起始部下2 mm處放置6/0絲線備用。穩(wěn)定10 min，待心臟恢復(fù)規(guī)律性跳動時，結(jié)扎LAD，以心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段抬高0.1 mV或T波高聳，心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志。結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線，再灌注120 min，以缺血區(qū)心肌變紅，抬高的ST段或T波回落為再灌注成功的標(biāo)志。S組：絲線穿過LAD但不結(jié)扎；I/R組：結(jié)扎LAD30 min，再灌注120 min，在再灌注前3 min單次注射生理鹽水1 mL，吸入純氧3 min。SP組：在再灌注前3 min單次注射生理鹽水1 mL，吸入2%七氟醚3 min，余同I/R組；SP+Zn組：操作同七氟醚后處理組，但在給予七氟醚前，靜脈注射 HO-1 抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)(5 μg/kg)稀釋液1 mL；Zn組：在缺血心肌再灌注前3 min靜脈注射ZnPP(5 μg/kg)稀釋液1 mL，吸入純氧3 min。實驗期間，鹽水紗布覆蓋切口，保證大鼠肛溫保持在(36.5～37.5)℃。

1.3 血漿肌鈣蛋白(cTn-I)的測定 再灌注120 min 時，經(jīng)腹主動脈采血2 mL于真空促凝管，靜置10 min后4 000 r/min離心10 min，取上層清液，用大鼠cTn-I酶聯(lián)免疫吸試驗(ELISA)試劑盒(BioSwamp)檢測。

1.4 心肌組織HO-1的表達 切取約300 mg的心尖缺血心肌置于-80 ℃冰箱保存。將心肌組織稱質(zhì)量、剪碎、加裂解液(1∶10)，14 000 r/min離心5 min后取上層清液用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果加入蛋白樣品和上樣緩沖液，用電轉(zhuǎn)儀將凝膠上分離到的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%BCA封閉2 h，用兔抗鼠HO-1抗體(稀釋度1∶25 000，ABCAM公司)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(稀釋度1∶550，武漢博士德生物工程有限公司)4 ℃孵育過夜，次日用過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋度1∶3 500，武漢博士德生物工程有限公司)孵育2 h，洗膜后用電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液顯影。采用凝膠成像系統(tǒng)進行分析，以目的蛋白條帶灰度值和GAPDH條帶灰度值的比值反映HO-1的表達。

1.5 心肌組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量測定 再灌注120 min后，處死大鼠，取結(jié)扎點以下缺血區(qū)心肌組織，加預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液制成10%組織勻漿。黃嘌呤氧化酶法測定SOD含量；硫代巴比妥酸顯色測定脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1 血清 cTn-I含量的比較 與S組比較，其余各組血清cTn-I含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與I/R 組比較，SP 組 cTn-I 含量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；I/R組、SP+Zn組及Zn組組間cTn-I含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 心肌組織HO-1蛋白的比較 各組心肌HO-1的表達，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與S組比較，其余各組心肌HO-1表達明顯上調(diào)(P<0.05)；與I/R 組比較，SP組心肌HO-1表達明顯上調(diào)(P<0.05)；I/R組、SP+Zn組及Zn組間HO-1表達，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.3 心肌組織SOD活性、MDA含量比較 與S組比較，其余各組心肌組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與I/R組比較，SP組心肌組織SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；I/R組與SP+Zn組、Zn組比較，心肌組織SOD活性和MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌組織cTn-I、HO-1、MDA含量和SOD活性比較(±s)

3 討 論

本實驗參考文獻[7]確定了七氟醚的給藥濃度、方式，建立模型穩(wěn)定。在對結(jié)果的分析當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，相比較于I/R組，SP組的SOD活性明顯升高，MDA含量明顯下降，cTn-I含量也明顯降低。提示經(jīng)過七氟醚后處理的心肌缺血大鼠在再灌注后心肌損傷程度有明顯減輕。在對七氟醚后處理的MIRI保護機制的研究中，被最早觀察到的是絲裂原活化激酶p42和p44的激活和NO的生成[8]，之后磷脂酞肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3k-AKT)[9]、鈉巴霉素的哺乳動物靶子/70KD核糖體蛋白s6激酶和一氧化氮合成酶也被發(fā)現(xiàn)起到了一定作用[10-11]。MIRI損傷程度可通過心肌組織氧化損傷程度反映，而SOD活性和MDA含量的檢測能夠有效反映組織氧化損傷程度[12]。SOD是一種源于有機體、能夠清除氧自由基的特異性酶，也是在生物體內(nèi)清除氧自由基的首要物質(zhì)。因此SOD活性可直接反映機體對氧自由基的清除和抗氧化能力。MDA是細胞膜上不飽和脂肪酸受到氧自由基攻擊后的標(biāo)志物，其含量變化也可反映機體組織過氧化損傷程度。

本次實驗在建造模型時還引入HO-1抑制劑ZnPP，在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)加入ZnPP的SP+Zn組和Zn組的血清cTn-I含量、組織MDA含量都較SP組升高，SOD活性有明顯下降，與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外在通過對HO-1蛋白含量的檢測中發(fā)現(xiàn)，SP+Zn及Zn兩組的HO-1蛋白含量也比SP組明顯降低，與I/R組差別不大。提示了七氟醚對MIRI后處理的保護機制主要是通過誘導(dǎo)HO-1蛋白表達來完成的。血紅素氧合酶(HO)在機體內(nèi)有三種同工酶：HO-1、HO-2、HO-3。其中HO-1是可誘導(dǎo)型，是一種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物，也是熱休克蛋白家族中的一個成員，又稱HSP-32。前文已述，HO-1可通過將血紅素降解為膽綠素、二價鐵離子和CO發(fā)揮對組織的抗氧化損傷作用。其中，膽綠素可進一步還原為膽紅素，二者可以發(fā)揮清除氧自由基和脂質(zhì)過氧化物酶的作用[13]。二價鐵離子則可以通過調(diào)節(jié)鐵蛋白的方式達到清除氧自由基的目的[14]。雖然NO、一氧化氮合成酶均可對MIRI有保護作用，但是NO的保護作用卻是兩面性的，NO在低濃度時有擴張冠脈、降低再灌注中性粒細胞激活的作用，而高濃度的NO卻對心肌組織有負性肌力作用，并可與氧迅速反應(yīng)生成大量氧自由基加重損傷[15]。而HO-1催化生成的CO具有反饋性抑制NO大量合成的作用，從而減輕組織的損傷[14]。

綜上所述，七氟醚后處理作為一種更安全、簡便且更貼近臨床的方式，對MIRI有明顯保護作用，并且通過HO-1的表達發(fā)揮作用。但HO-1的表達升高是被七氟醚通過什么機制所誘導(dǎo)還有待進一步研究。

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(本文編輯王雅潔)

山西省自然科學(xué)基金面上項目(No.2014011040-9)

1.山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)；2.山西博愛醫(yī)院；3.山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院

通訊單位：范志強， E-mail：fankm@163.com

R542.2 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.09.009

1672-1349(2017)09-1048-03

2017-02-21)

引用信息：李翔 ，范志強，王建剛,等.血紅素氧合酶-1在七氟醚后處理心肌缺血再灌注損傷保護中的作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(9)：1048-1050.