慢性蜜蜂麻痹病毒中國株RNA1序列克隆及進化分析

李貝貝 侯春生 刁青云

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

慢性蜜蜂麻痹病毒中國株RNA1序列克隆及進化分析

李貝貝 侯春生 刁青云

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京100093）

慢性麻痹病是成蜂中的一種傳染性疾病，患病蜜蜂呈現一些神經性行為如顫抖、爬行，能引起兩種不同的癥狀，可導致蜜蜂體表發黑光亮無毛或腹部膨大。該病的病原體是慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic bee paralysis virus，以下簡稱CBPV），對其致病性起決定性作用的是RNA依賴RNA聚合酶（RdRp），而RdRp位于CBPV基因組的RNA1片段上。為了深入理解CBPV的感染特點及致病機理，本文克隆中國北京株CBPV RNA1的全基因組序列并對其進行了遺傳進化分析，為深入開展病毒研究提供信息數據。

慢性蜜蜂麻痹病毒；序列分析；RNA依賴的RNA聚合酶；進化特點

1 引言

蜜蜂是糧食作物開花授粉的重要媒介昆蟲之一，不僅為人類提供多種多樣的蜂產品而且通過授粉產生更大的經濟效益。在世界農業范圍內蜜蜂通過授粉創造的價值約為1750億美元[1]，僅在歐洲和北美大約為170～180億美元[2，3]。但是蜜蜂的健康正受到多個病原及環境壓力的影響，從寄生性瓦螨、RNA病毒和微孢子蟲等致病因子到環境中的農藥等，都會導致蜂群數量持續下降[4，5]。尤其是自2007年發現IAPV是引起蜜蜂崩潰癥的主要病毒之一，病毒病被發現在全球分布廣泛且危害巨大。同樣，CBPV在近兩年對我國蜂群造成了較大的影響，分布也較廣。

慢性麻痹病是成蜂中的一種傳染性疾病，在1963年被首次發現[6]。其感染主要的癥狀是：行為上，患病蜜蜂身體顫抖，翅膀不對稱外翻狀態和只能在地上爬行不能飛行，幾天后巢門口聚集大量死蜂；體表上，蜜蜂體色發黑或腹部膨大。大多數情況下主要通過食物和表皮傷口傳播，健康蜂通過與病蜂接觸或者哺育蜂清理病蜂糞便時被感染[7]。

CBPV是長度30～60 nm，寬度20 nm的非等軸無包膜病毒粒子[8]。它是單鏈正義RNA病毒，由兩段基因組成，分別是 RNA1和 RNA2，已知的參考株（EU122229）RNA1長度3674個核苷酸，（EU122230）RNA2包含2305個核苷酸[9]，有實驗顯示CBPV的RNA3’端不含多聚腺苷酸尾但有一個閉鎖結構，5’端有一個帽子結構。RNA1和RNA2分別編碼三個和四個開放閱讀框[9]。Olivier V在2002年提交了兩個基因序列 CBPV-B-441（EU122231） 和 CBPV A-79P（EU122229），兩個序列長度分別為3658 nt和3678 nt[9]。Philippe Blanchard擴增獲得9個國家（奧地利、比利時、丹麥、法國、匈牙利、波蘭、西班牙、瑞士、烏拉圭）22個蜜蜂樣品中的CBPV RNA1的ORF3序列，序列號從FJ345306到FJ345327長度為1947 nt，以獲得不同地區CBPV的親緣關系[10]。Kojima在Genbank提交了日本株 CBPV RdRp區序列，序列號從 AB682795到AB682799，長度都為469 nt。吳艷艷等擴增中國地區17個蜜蜂樣品的CBPV RNA1 RdRp區序列，序列號從KM036169到KM036185，長度都不超過400 bp[11]。至今為止CBPV并未被病毒國際分類委員會進行種屬分類(ICTV)，只有RNA1中的ORF3區與野田病毒科和番茄矮叢病毒科同源性較高，因此推測RNA1的ORF1和ORF3編碼非結構蛋白，RNA2的ORF2和ORF3編碼結構蛋白[12]。CBPV RNA1中包含許多重要信息，大多數研究克隆序列較短，Genbank數據庫中僅有三條全基因組序列。因此本研究通過克隆獲得北京CBPV RNA1的全基因組序列，以期獲得更多的病毒信息。

2 材料與方法

2.1 樣本采集

在中國農業科學院蜜蜂研究所內采集有明顯黑腹癥狀的意大利蜜蜂（Apis mellifera mellifera）爬蜂，采集的樣品迅速放置于-80℃冰箱保存。

2.2 RNA提取

將蜜蜂樣品置于1.5 ml無菌管中，用電動組織研磨器在液氮中將蜜蜂研磨成細粉狀，隨后加入Trizol（Invitrogen美國），之后用氯仿和異丙醇按照RNA提取操作步驟提取RNA，用TE溶解，在-20℃冰箱中保存。

2.3 反轉錄、PCR和克隆

按照反轉錄（Promega美國）試劑盒說明書合成cDNA，使用Primer 5.0依據實驗要求共設計5對引物，覆蓋CBPV的全長，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

克隆CBPV各個片段。PCR反應液：cDNA模板為1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，2×Es Taq Master－Mix（康為世紀中國）10 μl，無菌水7 μl。反應條件為：94℃3 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃0.5～2 min（由克隆片段長度決定），共34個循環，72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒（天根中國）回收目的條帶。

按照全試金克隆試劑盒說明書（全試金中國）將目的片段連接到pEASY-T1載體上，連接產物轉化進Trans1-T1感受態細胞中，進行陽性克隆檢測，將陽性菌株送去生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.4 CBPV RNA1全長及RdRp進化樹構建

目前在GenBank上公布的CBPV RNA1全基因組序列僅有3株，名稱及登錄號分別為：France B-441 (EU122231)、France A-79P (EU122229)、China LN（KU950353）。將本實驗中得到的序列KX168412與這3株CBPV RNA1序列構建進化樹，并以以色列急性麻痹病毒IAPV（EU218534）全基因組序列作為進化樹外群，用Mega6分析軟件中的Clustal W程序進行多重序列對齊分析，使用鄰接法（Neighbour-Joining）Bootstrap重復1000次構建進化樹。

在GenBank上公布的CBPV RNA1序列中能夠全部覆蓋RdRp區的序列共25條，使用Mega6軟件分析中的Clustal W程序對這25株和本文得到的序列進行多重序列對齊分析，使用鄰接法（Neighbour-Joining）Bootstrap重復1000次構建進化樹。

3 實驗結果

3.1 CBPV基因拼接及全基因組進化樹分析

使用DNAman將5段CBPV RNA1序列拼接在一起，基因總長度為3657 nt的序列，提交Genbank數據庫登錄號為KX168412。將 KX168412與其他三株CBPV RNA1序列共同構建進化樹。結果如圖1所示，括號中為各個序列的登錄號。

圖1 CBPV RNA1全基因組系統發育進化樹

通過 NCBI中的 BLAST將本文中所獲得的KX168412與全部3株CBPV RNA1基因組序列進行比對分析，結果顯示China BJ（KX168412）與China LN（KU950353）相似度最高為98%，其次為France B-441 (EU122231)相似度為 96%，與 France A-79P (EU122229)相似度最低91%。

全基因組序列進化樹分析結果顯示，所有CBPV RNA1基因型都區別于IAPV的全基因組序列。在CBPV RNA1基因型中，進化樹主要是一個大的分支，其中，France B-441(EU122231)與 France A-79P (EU122229)的同源性最高；China BJ（KX168412）與China LN（KU950353）的同源性高，在進化關系上KX168412要高于France B-441(EU122231)、France A-79P(EU122229)、China LN（KU950353）。

3.2 CBPV RNA1 BJ株全基因結構及RdRp區進化分析

使用DNAman預測CBPV RNA1的ORF區，經預測，China BJ(KX168412)含有三個ORF區域，包括ORF1（19-2575）、ORF2（32-887）、ORF3（1643-3587）。

使用Mega6采用鄰近法，進行系統進化樹分析，對已克隆并測序的China BJ(KX168412)序列的RdRp區與NCBI數據庫的其他已報道25條CBPV毒株（長度為1974 nt）構建進化樹。圖2進化樹結果顯示，有四個主要的集群，第一個集群包括一個法國株序列，兩個瑞士株序列和所有的波蘭株、奧地利株、丹麥株和匈牙利株；第二個集群包括兩個烏拉圭株；第三個集群包括三個法國株和一個瑞士株、一個烏拉圭株、兩個中國株序列；第四個集群包括法國株、西班牙株和比利時株。本文 得 到 的 China BJ（KX168412） 與 China LN（KU950353）的同源性最高，其次與France B-441、Switzerland R3 C10和Uruguay 6-M同源性較為相近。

圖2 不同國家CBPV RNA1 RdRp區系統發育進化樹

4 討論

NCBI最長的CBPV RNA1基因序列是法國株，其序列號是EU122229，長度為3674 nt，比China BJ (KX168412)長17 nt[9]。經Blast比對，本文中所得到RNA1的序列與法國株（EU122229）序列的同源性達到98%。

RdRd是病毒復制的關鍵酶，對于病毒的傳播和表達具有重要意義。Olivier V在2008年推測RNA1的ORF3氨基酸序列可能編碼RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)區域[9]。經過比對發現我們克隆所得到的ORF3區與多個病毒的RdRd區高度相似。Olivier V的分析表明CBPV法國株介于番茄叢矮病毒科和野田村病毒科之間，但并不屬于任何病毒科。因此選擇ORF3區與其他國家CBPV病毒株進行進化樹分析，以期獲得更多關于CBPV分類的信息。

用 ORF Finder對 GenBank上其他 3株 CBPV RNA1全基因組序列進行分析，預測開放閱讀框結果顯示四株序列都含有3個ORF區。其中France B-441 (EU122231)、France A-79P(EU122229)和 China BJ (KX168412)三條序列的三個ORF區所含氨基酸數目相等，分別是852（ORF1）、285（ORF2）、648（ORF3）個氨基酸，而China LN（KU950353）序列的ORF1區含有784個氨基酸，比上述三株序列中的ORF1區少68個氨基酸。

進化分析結果顯示烏拉圭株、瑞士株和法國株出現在多個集群中，沒有明顯的地域差異。第一集群中的CBPV RdRp序列主要集中在歐洲北部和東部；第二個集群主要集中在南美洲；第四個分支主要包括歐洲的南部和西部；第三個集群包括法國株、瑞士株、烏拉圭株和兩個中國株序列，其中兩個中國株序列聚為同一類，同源性較為相近，屬亞洲區域，但是從整體上看這一分支中的CBPV并無明顯地域差異，可能與頻繁的商業交換或者病毒變異有關。另外法國株序列出現在三個分支中，出現比例明顯高于其它地區CBPV株。因此可能需要更多的CBPV RdRp序列才能得到更詳細和精確的地域差異。

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Clone and Phylogenetic Analysis of Chronic Bee Paralysis Virus China RNA1 Sequence

Li Beibei,Hou Chunsheng,Diao Qingyun
(Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100093)

Chronic bee paralysis virus is a contagious disease of adult honeybees,and diseased bee displayed several neurological symptoms such as trembling,crawling.And it can induce two kinds of significant different symptoms,black bright hairless or bloated abdomen.The pathogen of this disease is Chronic bee paralysis virus(CBPV), and RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)plays a vital role in the pathogenesis for the CBPV and positioned at the RNA 1 segment of CBPV genome.In order to better understand the mechanism of CBPV,we cloned the full genome of RNA 1 of CBPV and made a phylogenetic analysis on that.These results provided the fundamental data for studying the infection characterization of CBPV.

Chronic bee paralysis virus;phylogenetic analysis;RNA-dependent RNA polymerase;evolution characteristics

中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-2017-IAR）

李貝貝（1991-），女，碩士研究生，研究方向為蜜蜂病蟲害，E-mail：15600928925@163.com

刁青云，女，研究員，從事蜜蜂病害研究工作，E-mail:dqyun1@126.com