黃芩素對氧化應激狀態下白癜風黑素細胞線粒體超微結構和功能的影響

朱龍飛 田 軍 堅 哲 張偉剛 劉邦民 李春英 高天文

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·論著·

黃芩素對氧化應激狀態下白癜風黑素細胞線粒體超微結構和功能的影響

朱龍飛1,2田 軍1,3堅 哲1張偉剛1劉邦民1李春英1高天文1

目的： 明確黃芩素對氧化應激狀態下白癜風黑素細胞(PIG3V)線粒體超微結構和功能的影響。方法： 常規培養白癜風黑素細胞系PIG3V細胞，分為空白對照組、黃芩素組、H2O2組及黃芩素+H2O2組。電鏡觀察線粒體超微結構；MTT法檢測線粒體活性；流式細胞術檢測線粒體膜電位；熒光素酶報告系統檢測細胞ATP含量；RT-PCR檢測線粒體DNA拷貝數。結果： 與H2O2組比較，黃芩素+H2O2組線粒體結構損害輕，線粒體活性率、膜電位、ATP含量及DNA拷貝數高。結論： 黃芩素減輕氧化應激狀態下白癜風黑素細胞線粒體結構和功能損害，增強細胞抗氧化能力。

黃芩素； 白癜風； 黑素細胞； 線粒體； 氧化應激

白癜風的發病機制尚未充分闡明。基于自身免疫學說，臨床上外用糖皮質激素、免疫調節劑，以及NB-UVB照射等治療白癜風，可獲一定的治療效果。但是這些治療手段對于預防白癜風的復發以及對進展期白癜風的治療效果明顯不足。近年來，氧化應激學說得到普遍關注，并得到一系列實驗結果的支持。線粒體是細胞內活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)產生的主要部位，正常情況下其具有完善的抗氧化體系，當線粒體功能障礙時出現細胞內ROS堆積，導致線粒體損傷。研究發現，白癜風患者皮損處(角質形成細胞)和皮損周圍(黑素細胞及角質形成細胞)細胞線粒體超微結構損害，進一步支持氧化應激致病學說[1]。

我們課題組前期研究證實，黃芩素(Baicalein)抑制p38MAPK通路對抗正常人黑素細胞系(PIG1)氧化應激損傷，同時減少細胞色素C(Cytochrome c, CytC)釋放，通過抑制線粒體凋亡途徑保護PIG1細胞，但是具體機制尚不明確[2]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 電鏡為捷克FEI公司Tecnai G2型透射電子顯微鏡；BD FACSAria流式細胞分選儀為美國Backman公司生產；全自動酶標儀、IQ5實時熒光定量PCR儀為美國Bio-rad公司生產；254培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；30% H2O2溶液(分析純)為西安化學試劑廠產品；黃芩素購自美國Sigma公司；Red cm ROS購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒為碧云天生物技術有限公司生產；ENLITEN?ATP試劑盒購自美國Promega公司；線粒體DNA特征性基因ND4引物(上游序列：CCATTCTCCTCCTATCCCTCAAC；下游序列：CACAATCTGATGTTTTGGTTAAACTATATTT)由生工生物工程公司(上海)股份有限公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 白癜風患者表皮黑素細胞系(PIG3V)由美國伊利諾斯州芝加哥洛約拉大學Caroline Le Poole博士贈送，該細胞系運用逆轉錄病毒載體轉染16型HPV E6和E7開放讀碼框得來。PIG3V細胞為貼壁生長的人永生化細胞，使用含5%胎牛血清的254黑素細胞培養基(含血清黑素細胞培養基)，細胞種入25 cm2培養瓶、六孔板或96孔板中，恒溫培養箱培養，培養條件設置為37℃，5% CO2。

1.2.2 實驗分組及處理 依照我們課題組前期實驗的結果，我們采用0.75 mM H2O2培養基處理PIG3V細胞建立氧化應激模型[3]。對照組：黑素細胞培養基；單純黃芩素處理組：40 μM黃芩素液處理1 h，其后換用黑素細胞培養基。氧化應激組：0.75 mM H2O2處理；黃芩素預處理組：40 μM黃芩素液處理1h,其后換用0.75 mM H2O2處理。

因線粒體超微結構和膜電位對氧化應激較為敏感，所以線粒體超微結構觀察實驗和線粒體膜電位檢測實驗在24 h收取標本，其他實驗分別在24 h、48 h收取標本。

1.2.3 線粒體超微結構觀察 細胞常規消化，將1培養瓶(25 cm2)細胞收集至10 mL離心管中，1000 g離心5 min，棄上清，重懸，將細胞懸液移入0.5 mL EP管中，2000 g離心8 min，小心抽去上清液，加2.5%戊二醛溶液4℃固定24 h。固定好的標本交由第四軍醫大學解剖學教研室電鏡中心制作透射電鏡切片，透射電鏡下觀察。

1.2.4 MTT法檢測線粒體活性 具體步驟：a.向96孔板每孔中加入1×MTT溶液50 μL，另選取無細胞的4孔各加入150 μL DMSO作空白對照組；b.37 ℃，5 % CO2、100 %濕度孵育4 h；c.將96孔板置平板搖床上，室溫，80 rpm振搖5 min；d.全自動酶標儀570 nm波長處檢測光密度(OD)；e.線粒體活性率計算：每個檢測值均減去本底(空白對照組)的平均值。線粒體活性率=處理組OD/對照組OD。

1.2.5 流式細胞術檢測線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential, MMP) MMP檢測方法：a.將Red cm ROS用254培養基按1∶5000稀釋成工作液，避光保存；b.向培養細胞的六孔板每孔加入2 mL工作液，37℃孵育30 min；c.常規消化，收集細胞至離心管中，無菌生理鹽水洗1次，離心，棄上清；d.向每管細胞中加入500 μL生理鹽水重懸，移入流式管中，上流式細胞儀，選擇PE通道，檢測X-mean。

1.2.6 線粒體ATP產量變化檢測 細胞常規消化，用254培養基重懸，使用細胞計數板計數，每組各取4500個細胞進行下一步實驗；向細胞中加入2%三氯乙酸50 μL/管，室溫靜置10 min后向管中加入50 μL 4%三羥甲基氨基甲烷中和，1000 g離心3 min，取上清；使用ENLITEN?ATP檢測試劑盒，用熒光素酶報告系統檢測樣品RLU值；使用試劑盒中ATP標準品配制梯度濃度的ATP溶液，檢測梯度濃度ATP溶液各自的RLU值；按照ATP濃度梯度和所測得的RLU值，建立RLU值-ATP濃度的標準曲線，求得擬合公式；按照擬合公式和所測RLU值計算各樣品ATP含量。

1.2.7 RT-PCR技術檢測線粒體DNA拷貝數，觀察線粒體生物合成情況 收集細胞，按照天根血液/組織/細胞基因組DNA提取試劑盒說明書操作步驟，提取全基因組DNA；分光光度計測DNA樣品濃度；Real-time PCR法檢測線粒體DNA拷貝數，選取線粒體DNA特征性基因ND4為檢測目標，β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算對特異性擴增的目的基因進行相對定量。

1.2.8 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。采用one-way anova檢驗，各組數據兩兩比較，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩素對氧化應激狀態下PIG3V細胞線粒體結構的影響 線粒體超微結構觀察顯示，對照組和單純黃芩素處理組細胞線粒體結構清晰、完整，線粒體嵴無腫脹，未見線粒體空泡化(圖1a，1b)。氧化應激條件下PIG3V細胞部分線粒體出現空泡化改變，未空泡化的線粒體也出現了超微結構損害，如線粒體內膜腫脹、嵴增厚、嵴減少(圖1c)。黃芩素預處理后的再予以氧化應激刺激PIG3V細胞中未見線粒體空泡化，線粒體結構清晰、完整，僅有部分線粒體嵴輕度腫脹(圖1d)，較氧化應激組PIG3V線粒體超微結構損害明顯減輕。可見黃芩素預處理后PIG3V細胞線粒體抗氧化應激能力增強，線粒體超微結構損害改善。

2.2 黃芩素對氧化應激狀態下PIG3V細胞線粒體活性率的影響 處理后24 h氧化應激組線粒體活性率較對照組下降45.77%(P<0.05)，黃芩素預處理組較氧化應激組未見明顯差異(P>0.05)。處理后48h時氧化應激組線粒體活性率較對照組下降40.67%(P<0.05)，而黃芩素預處理組較氧化應激組升高35.53%(P<0.05)。結果見圖2a。

2.3 黃芩素對氧化應激狀態下PIG3V細胞線粒體膜電位的影響 流式細胞術檢測顯示：氧化應激條件下PIG3V細胞膜電位較對照組下降26.93%(P<0.05)。黃芩素預處理組較氧化應激組升高37.54%(P<0.05)。結果見圖2b。

2.4 黃芩素對氧化應激狀態下PIG3V細胞線粒體ATP含量的影響 細胞內ATP含量處理后24 h各實驗組差異無統計學意義。48 h時氧化應激組較對照組降低60.03%(P<0.05)，黃芩素預處理組較氧化應激組組升高210.4%(P<0.05)。結果見圖2c。

2.5 黃芩素對氧化應激狀態下PIG3V細胞線粒體DNA拷貝數的影響 處理后24 h，單純黃芩素處理組線粒體DNA拷貝數較對照組升高340%(P<0.05),氧化應激組較對照組未見明顯差異；黃芩素預處理組較氧化應激組升高113%(P<0.05)。48 h后單純黃芩素處理組線粒體DNA拷貝數較對照組未見明顯差異，氧化應激組線粒體DNA拷貝數較對照組下降75.33%(P<0.05)，而黃芩素預處理組較氧化應激組升高182.3%(P<0.05)。結果見圖2d。

圖1 黃芩素對氧化應激下PIG3V細胞線粒體超微結構的影響(a.對照組；b.單純黃芩素組；c.氧化應激組；d.黃芩素預處理組。圖中紅色箭頭所指為線粒體嵴，藍色箭頭所指為空泡化的線粒體)

圖2 a：黃芩素對氧化應激下PIG3V細胞線粒體活性率的影響(n=3，*P<0.05)；b：黃芩素對氧化應激下PIG3V細胞線粒體的膜電位的影響(n=3，*P<0.05)；c：黃芩素對氧化應激下PIG3V細胞ATP含量的影響(n=3，*P<0.05)；d：黃芩素對氧化應激下PIG3V細胞線粒體DNA拷貝數的影響(n=3，*P<0.05)

3 討論

線粒體是真核細胞“動力工廠”，它除了合成ATP之外，還具有多種重要的功能，包括產生ROS、調節氧化還原電位、細胞氧化還原信號轉導、調控細胞凋亡和基因表達等。細胞中95%的ROS來源于線粒體，線粒體既是ROS產生的主要場所，又是ROS攻擊的主要靶細胞器[4]。

氧化應激導致白癜風患者黑素細胞破壞，而氧化應激導致的線粒體損傷是黑素細胞破壞的重要原因，因為線粒體損傷誘導的線粒體凋亡途徑是細胞凋亡主要途徑之一。線粒體損傷后MMP下降，ATP產生減少，Cyt C釋放至胞漿，形成Cyt C/Apaf-1/procaspase-3凋亡復合體，引起procaspase-3激活成caspase-3進而引起細胞的凋亡[5]。

本實驗中用H2O2處理PIG3V細胞，結果顯示線粒體超微結構損害，線粒體活性下降，MMP水平下降，ATP生產能力下降，提示線粒體功能障礙。而單獨用黃芩素處理PIG3V細胞，線粒體活性、MMP、細胞ATP含量等指標與對照組比較未見明顯差異。可見黃芩素直接提高PIG3V細胞線粒體功能的作用并不明顯。黃芩素可能是通過間接途徑提高線粒體功能的。本實驗中H2O2可抑制細胞內的線粒體生物合成，降低細胞mtDNA拷貝數。而黃芩素單獨作用于PIG3V細胞后24 h，即表現出對線粒體生物合成明顯的促進作用，使線粒體DNA拷貝數明顯增加，此作用在24 h時最明顯，其后則逐漸減弱。我們推測黃芩素促進氧化應激下線粒體的生物合成，提高線粒體活性率、線粒體膜電位、ATP含量，抵消了氧化應激造成的線粒體數量損失和功能下降，是黃芩素改善氧化應激下線粒體功能障礙的可能機制。

有文獻報道，在6-OHDA誘導的氧化應激模型中，黃芩素通過激活Keap1/Nrf2/HO-1通路保護PC12細胞[6]；在V79-4細胞造成氧化應激損傷模型中，黃芩素可激活 Nrf2通路，升高MnSOD蛋白表達水平，抵抗氧化應激對細胞的損傷[7]。我們課題組前期研究證實過表達Nrf2可以促進黑素細胞線粒體生物合成相關基因和蛋白(NRF1、TFAM)的表達，進而促進線粒體生物合成、上調線粒體功能相關的指標，改善白癜風患者黑素細胞的線粒體功能[8]。以上結果提示黃芩素可能是通過Nrf2-NRF1-TFAM途徑促進線粒體生物合成，補充新的線粒體，抵消氧化應激造成的線粒體結構損害和功能下降，進而提高黑素細胞抗氧化能力。

[1] Prignano F, Pescitelli L, Becatti M, et al. Ultrastructural and functional alterations of mitochondria in perilesionalvitiligo skin[J]. J Dermatol Sci,2009,54(3):157-167.

[2] Liu B, Jian Z, Li Q, et al. Baicalein protects human melanocytes from H2O2-induced apoptosis via inhibiting mitochondria-dependent caspase activation and the p38 MAPK pathway[J]. Free Radic Biol Med,2012,53(2):183-193.

[3] 田軍,朱龍飛,堅哲,等.過氧化氫誘導人黑素細胞氧化應激損傷模型的建立[J].實用皮膚性病學雜志,2014,7(6):406-410.

[4] Murphy MP. How mitochondria produce reactive oxygen species[J]. Biochem J,2009,417(1):1-13.

[5] Stevens JM. Cytochrome c as an experimental model protein[J]. Metallomics,2011,3(4):319-322.

[6] Zhang Z, Cui W, Li G, et al. Baicalein protects against 6-OHDA-induced neurotoxicity through activation of Keap1/Nrf2/HO-1 and involving PKCalpha and PI3K/AKT signaling pathways[J]. J Agric Food Chem,2012,60(33):8171-8182.

[7] Lee IK, Kang KA, Zhang R, et al. Mitochondria protection of baicalein against oxidative damage via induction of manganese superoxide dismutase[J]. Environ Toxicol Pharmacol,2011,31(1):233-241.

[8] 朱龍飛,田軍,堅哲,等.過表達Nrf2對白癜風黑素細胞線粒體生物合成和功能的影響[J].中華皮膚科雜志,2015,48(6):5-9.

(收稿：2016-09-07 修回：2016-12-14)

Effects of baicalein on the mitochondrial ultrastructure and function in stressed vitiligo melanocytes

ZHULongfei1,2TIANJun1,3,JIANZhe1,ZHANGWeigang1,LIUBangmin1,LIChunying1,GAOTianwen1.

1DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China; 2No.538HospitalofPLA,Hanzhong723000,Shaanxi,China; 3OutpatientDepartmentofNo.63600ArmyofPLA,Jiuquan732750,Gansu,China

GAOTianwen,E-mail：gaotw@fmmu.edu.cn

Objective: To determine the effects of baicalein (BE) on the mitochondrial ultrastructure and function in stressed vitiligo melanocytes. Methods: The vitiligo melanocyte line (PIG3V) cells were cultured in vitro, and then, were divided into the blank control group, baicalein group, H2O2group and baicalein+H2O2group. The ultrastructure changes of mitochondria were observed under electron microscope. The mitochondrial activity, mitochondrial membrane potential (MMP), level of intracellular ATP, copy number of mitochondrial DNA (mtDNA) were detected by MTT, flow cytometry, ENLITEN ATP assay kit and real-time PCR (RT-PCR) respectively. Results: Compared with the H2O2group, the level of the damage of mitochondrial ultrastructure was lower and the level of mitochondrial activity, MMP, intracellular ATP, copy number of mitochondrial DNA (mtDNA) were higher in the baicalein+H2O2group. Conclusion: BE protects the structure and function of mitochondria from the damage of oxidative stress and enhances the anti-oxidative ability of PIG3V cells.

baicalein; vitiligo; melanocyte; mitochondria; oxidative stress

國家自然科學基金資助項目(編號：81373844，81402599)

1第四軍醫大學西京皮膚醫院，陜西西安，710032 2解放軍第538醫院，陜西漢中，723000 3解放軍63600部隊司令部門診部，甘肅酒泉，732750

高天文，E-mail：gaotw@fmmu.edu.cn