GABRP基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病易感性的相關(guān)性

歐運(yùn)超 宋繼權(quán) 裴 颯 彭瑋慧

?

·論著·

GABRP基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病易感性的相關(guān)性

歐運(yùn)超 宋繼權(quán) 裴 颯 彭瑋慧

目的： 明確γ氨基丁酸A受體π亞基(GABRP)基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病易感性之間的關(guān)系。方法： PCR擴(kuò)增111例SLE患者和120名正常對照者外周血目的基因片段,通過二代測序?qū)δ康幕蚱芜M(jìn)行測序檢測rs929763位點(diǎn)和rs3805455位點(diǎn)的多態(tài)性。結(jié)果： GABRP rs929763TT、AT基因型頻率在SLE組與對照組中分別為99.1%、0.9%和95.8%、4.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA、GG基因型頻率在SLE組與對照組中分別為45.0%、9.9%、45.0%和45.8%、8.3%、45.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、G等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為32.4%、67.5%和50.0%、50.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： GABRP 基因SNP位點(diǎn)rs929763和rs3805455多態(tài)性可能與SLE的發(fā)病無關(guān)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； 單核苷酸基因多態(tài)性； γ氨基丁酸A受體π亞基

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)是一種多系統(tǒng)損害的結(jié)締組織病，發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，目前研究表明，遺傳和環(huán)境在發(fā)病中都發(fā)揮了重要作用[1,2]。γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 是一種存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，最近幾年，關(guān)于GABA及其受體在外周非神經(jīng)組織如腫瘤組織、淋巴組織等中表達(dá)，從而介導(dǎo)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)對細(xì)胞的調(diào)控成為研究熱點(diǎn)[3]。最近國外有研究報(bào)道，GABRP基因多態(tài)性與SLE發(fā)病具有相關(guān)性[4]。本文主要研究中國地區(qū)GABRP基因rs929763位點(diǎn)和rs3805455位點(diǎn)多態(tài)性與SLE的相關(guān)性，以探討GABRP基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機(jī)制中的作用。為其進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。同時(shí)為中樞神經(jīng)遞質(zhì)在結(jié)締組織疾病領(lǐng)域的研究提供新的視野。

1 材料和方法

1.1 研究對象 111例SLE女性患者資料均收集于2015年6月至2016年4月武漢大學(xué)中南醫(yī)院和武漢大學(xué)人民醫(yī)院門診和住院患者，平均年齡45.2歲，以1982年美國風(fēng)濕病學(xué)會修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)為診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對照組120名女性，為武漢大學(xué)中南醫(yī)院體檢中心健康體檢者，平均年齡40.1歲，并排除SLE、干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、皮肌炎等自身免疫病，且一、二、三級親屬無SLE患者，研究對象間均無親緣關(guān)系。本研究已通過武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并在實(shí)施過程中遵守赫爾辛基宣言，所有病例及對照均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 5424臺式離心機(jī)(Eppendorf公司)，S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BIO-RAD公司)，DYY-6C 電泳儀(北京六一儀器廠)，Tanon 1600 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；2xTsingKe Master Mix(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)，GABRP等位基因序列特異性引物由武漢達(dá)邦生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 取受檢者外周靜脈血5 mL，標(biāo)本于4℃冰箱中貯存，3天內(nèi)進(jìn)行DNA提取。

1.3.2 提取DNA 采用苯酚-蛋白酶K法提取外周血基因組DNA，采用紫外分光光度計(jì)測定DNA含量及濃度，A260/A280>1.8。

1.3.3 特異性PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[4]方法擴(kuò)增GABRP基因rs929763位點(diǎn)：上游引物5'-TCCAGGTGTCTGGAGAGAGG-3'，下游引物5' -CAGCAGGGGCTCTAATCTTG-3'，PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min 后，94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增片段為236 bp；以及rs3805455位點(diǎn)：上游引物5' -GCTGGCCCTGAGTACTGAAC-3'，下游引物5' -CTCTGGCTGGATTTGGAGAG-3'， PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min 后，94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增片段為272 bp。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(含溴乙啶)電泳，經(jīng)紫外光透射在泳道中見明顯DNA條帶為陽性。

1.3.5 二代測序 將DNA樣本進(jìn)行上機(jī)測序(此過程由武漢達(dá)邦生物科技有限公司完成)。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用直接計(jì)數(shù)法分別對SLE組和正常組進(jìn)行等位基因和基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SPSS 17.0軟包件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。SLE組及正常對照組間的等位基因頻率及基因型頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，當(dāng)P<0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 rs929763位點(diǎn)和rs3805455位點(diǎn)PCR條帶瓊脂糖凝膠電泳圖 對GABRP基因的rs929763位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，可見到明亮的、單一的236 bp的目的基因條帶，沒有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物；對GABRP基因的rs3805455位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，可見到明亮的、單一的272 bp的目的基因條帶，沒有非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。

圖1 rs929763位點(diǎn)(左側(cè)箭頭所示)和rs3805455位點(diǎn)(右側(cè)箭頭所示)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

2.2 rs929763位點(diǎn)和rs3805455位點(diǎn)的多態(tài)性與SLE的相關(guān)性分析

2.2.1 rs929763位點(diǎn)和rs3805455位點(diǎn)的Hardy-weinberg檢驗(yàn) 根據(jù)Hardy-Weinberg定律算出各基因型的理論頻數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SLE組、對照組兩位點(diǎn)的P值均大于0.05，說明群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體。

2.2.2 rs929763位點(diǎn)和rs3805455位點(diǎn)的基因型頻率及等位基因頻率 GABRP rs929763TT、AT基因型頻率在SLE組與對照組中分別為99.1%、0.9%和95.8%、4.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA基因型頻率在SLE組與對照組中分別為45.0%、9.9%和45.8%、8.3%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、G等位基因頻率在SLE組與對照組中分別為32.4%、67.5%和50.0%、50.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具體見表1。

表1 GABRP基因多態(tài)性在SLE患者和對照組的分布

2.2.3 rs929763位點(diǎn)和rs3805455位點(diǎn)基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖 為進(jìn)一步驗(yàn)證二代測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)選擇SLE組rs929763位點(diǎn)和rs3805455位點(diǎn)7個(gè)樣本進(jìn)行一代測序(圖2、3)，測序結(jié)果提示兩位點(diǎn)基因突變(箭頭處)。

圖2 rs929763位點(diǎn)基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖

圖3 rs3805455位點(diǎn)基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是由多種因素所致并累及全身多臟器的系統(tǒng)性自身免疫病，研究表明遺傳、環(huán)境、性激素代謝異常、免疫失衡在發(fā)病中起重要作用。其中遺傳因素在SLE的發(fā)病中扮演重要角色，近年來，隨著人類基因組計(jì)劃的完成，使得SLE這一基因病在尋找易感位點(diǎn)成為可能。SLE易感基因的定位研究受到遺傳異質(zhì)性、臨床表現(xiàn)異質(zhì)性、外顯率低和民族背景多樣性的影響。所以基因多態(tài)性與SLE的相關(guān)性之間形成了非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA) 是一種存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其受體根據(jù)對激動劑及拮抗劑的敏感性分為三種類型：GABAA、GABAB、GABAC，其中GABAA受體是哺乳動物大腦中含量最高同時(shí)也是發(fā)揮作用最重要的受體，扮演著除神經(jīng)傳導(dǎo)功能及神經(jīng)調(diào)節(jié)功能外的多種角色。迄今為止，已在哺乳動物大腦中發(fā)現(xiàn)至少19個(gè)GABAA受體亞單位，分別由不同的基因?qū)ζ渚幋a，不同亞基組成的受體產(chǎn)生不同的生理效應(yīng)[5]。最近幾年，γ氨基丁酸在外周組織中的調(diào)節(jié)作用成為研究熱點(diǎn)，在腫瘤方面，美國Hildegard等[6]研究發(fā)現(xiàn)刺激性γ氨基丁酸B型受體信號作為異常的靶點(diǎn)，可以用于治療和預(yù)防胰腺癌。在免疫方面，Bhat和Soltani等[7,8]研究者報(bào)道了GABA可從老鼠巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞中提取，Stuckey等[9]研究者報(bào)道了GABA可從人類外周血巨噬細(xì)胞中提取。GABA與自身免疫性疾也有一定的關(guān)聯(lián)，Tian等[10]在模擬類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的老鼠中給予口服GABA，能夠減輕其關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，可能的機(jī)制是GABA抑制T細(xì)胞增殖，抑制抗原提成細(xì)胞的功能，減少血液中IgG2a抗體的產(chǎn)生，最終改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的炎癥反應(yīng)。Nigam等[11]研究者發(fā)現(xiàn)給銀屑病患者口服GABA類似物加巴噴丁和普瑞巴林可提高治療效果，其可能機(jī)制是GABA抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，從而減輕炎癥反應(yīng)。

韓國Kim等[4]研究者通過觀察164例SLE患者和528名健康對照，選擇GABRP基因的六個(gè)SNP位點(diǎn)(rs929763、rs732157、rs2303134、rs1063310、rs3805455和rs3828619)，采用高分辨熔解曲線(high-resolution melt，HRM)對DNA樣本SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，提示rs929763、rs732157、rs3805455和rs3828619四個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率在SLE組與對照組具有顯著差異(P<0.0001)；rs929763、rs3805455和rs3828619三個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻率在SLE組與對照組具有顯著差異(P=0.0005)，以上結(jié)果提示GABRP基因的上述SNP位點(diǎn)與SLE的發(fā)病具有相關(guān)性。作者為進(jìn)一步驗(yàn)證性別在SLE中是否為發(fā)病的重要因素，單獨(dú)統(tǒng)計(jì)了152例SLE女性患者的六個(gè)位點(diǎn)，結(jié)果提示rs929763、rs3805455和rs3828619三個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率在女性SLE組與女性對照組具有顯著差異(P<0.0001)；采用卡方檢驗(yàn)估算了rs929763、rs732157、rs2303134、rs1063310和rs3805455五個(gè)位點(diǎn)在SLE組和對照組中的單倍型頻率，結(jié)果提示單倍型(TCACC)在SLE組與對照組比較具有顯著差異(P=0.038)。

GABRP基因在腫瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面研究較多，但目前國內(nèi)沒有關(guān)于SLE的相關(guān)性研究，為進(jìn)一步證實(shí)該位點(diǎn)在中國漢族人群SLE發(fā)病的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)通過觀察111例SLE患者和120名健康對照，選擇兩個(gè)SNP位點(diǎn)(rs929763和rs3805455)，采用高通量基因分型對DNA樣本SNP位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示GABRP rs929763TT、AT基因型頻率在SLE組與對照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GABRP rs3805455AG、AA、GG基因型頻率在SLE組與對照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，A、G等位基因頻率在SLE組與對照組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。故GABRP基因與SLE的發(fā)病無相關(guān)性，GABRP SNP位點(diǎn)rs929763和rs3805455基因多態(tài)性可能不是中國漢族人群SLE的易感基因。

本研究與已報(bào)道的檢測結(jié)果不一致分析原因可能與種族、地域、實(shí)驗(yàn)方法等因素有關(guān)。同時(shí)本研究存在以下不足：實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本量選擇相對較少、位點(diǎn)選擇偏少、人種單一等。GABRP基因多態(tài)性與SLE的關(guān)系有待通過增加樣本量、選擇更多相關(guān)位點(diǎn)及擴(kuò)大區(qū)域研究來綜合分析。

[1] Wakeland EK, Liu K, Graham RR, et al. Delineating the genetic basis of systemic lupus erythematosus[J]. Immunity,2001,15(3):397-408.

[2] Parks CG, De Roos AJ. Pesticides, Chemical and industrial exposures in relation to systemic lupus erythematosus[J]. Lupus,2014,23(6):527-536.

[3] Sizemore GM, Sizemore ST, Seachrist DD, et al. GABA(A) receptor pi (GABRP) stimulates basal-like breast cancer cell migration through activation of extracellular-regulated kinase 1/2 (ERK1/2)[J]. J Biol Chem,2014,289(35):24102-24113.

[4] Kim HS, Jin EH, Mo JS, et al. The Association of the GABRP Polymorphisms with Systemic Lupus Erythematosus[J]. J Immunol Res,2015,2015:602154.

[5] Olsen RW, Sieghart W. International union of pharmacology. LXX. Subtypes of gamma-aminobutyric acid(A) receptors: classification on the basis of subunit composition, pharmacology, and function. Update[J]. Pharmacol Rev,2008,60(3):243-260.

[6] Hildegard M, Hussein AN, Mourad Majidi. The GABAB receptor is a novel drug target for pancreatic cancer[J]. Cancer,2008,112(4):767-778.

[7] Bhat R, Axtell R, Mitra A, et al. Inhibitory role for GABA in autoimmune inflammation[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(6):2580-2585.

[8] Soltani N, Qiu H, Aleksic M, et al. GABA exerts protective and regenerative effects on islet beta cells and reverses diabetes[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(28):11692-11697.

[9] Stuckey DJ, Anthony DC, Lowe JP, et al. Detection of the inhibitory neurotransmitter GABA in macrophages by magnetic resonance spectroscopy[J]. J Leukoc Biol,2005,78(2):393-400.

[10] Tian J, Yong J, Dang H, et al. Oral GABA treatment downregulates inflammatory responses in a mouse model of rheumatoid arthritis[J]. Autoimmunity,2011,44:465-470.

[11] Nigam R, El-Nour H, Amatya B, et al. GABA and GABA(A) receptor expression on immune cells in psoriasis: a pathophysiological role[J]. Arch Dermatol Res,2010,302(7):507-515.

(收稿：2016-11-06 修回：2016-12-21)

Association between GABRP gene polymorphisms and systemic lupus erythematosus

OUYunchao,SONGJiquan,PEISa,PENGWeihui.

DepartmentofDermatology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430071,China

SONGJiquan,E-mail:songjiq@126.com

Objective: To determine the association between the polymorphisms of the GABRP gene and systemic lupus erythematosus (SLE). Methods: The aim gene fragment extracted from the peripheral blood DNA of 111 SLE patients and 120 healthy controls was amplified by PCR. The single nucleotide polymorphism (SNP) in the GABRP gene at rs929763 and rs3805455 was detected by next generation sequencing. Results: The genotype frequencies of rs929763 TT, AT and rs3805455 AG, AA and GG in the patients were 99.1%, 0.9% and 45.0%, 9.9% and 45.0%, those in controls were 95.8%, 4.2% and 45.8%, 8.3% and 45.0% respectively. The allele frequencies of A and G in the patients were 32.4% and 67.5% and those in controls were 50.0% and 50.0%. There were no significant differences of AG, AA and GG frequencies between the patients and controls (P>0.05). Conclusion: There was no association between polymorphism of rs929763 and rs3805455 in the GABRP gene with SLE.

systemic lupus erythematosus; single nucleotide polymorphism; gamma-aminobutyric acid

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號：2013CFB263)

武漢大學(xué)中南醫(yī)院皮膚科，430071

宋繼權(quán)，E-mail: songjiq@126.com