二甲雙胍對行IVF/ICSI的PCOS患者妊娠結局及子宮內膜容受性的影響

孫東霞 王靖媛 趙哲琪 常梓殷 翟軍

(1.鄭州大學第一附屬醫院 生殖醫學中心 河南 鄭州 450052；2.聊城市人民醫院 生殖遺傳科 山東 聊城 252000)

二甲雙胍對行IVF/ICSI的PCOS患者妊娠結局及子宮內膜容受性的影響

孫東霞1,2王靖媛1趙哲琪1常梓殷1翟軍1

(1.鄭州大學第一附屬醫院 生殖醫學中心 河南 鄭州 450052；2.聊城市人民醫院 生殖遺傳科 山東 聊城 252000)

目的 探討二甲雙胍對多囊卵巢綜合征(PCOS)合并胰島素抵抗(IR)的不孕患者行體外受精/卵細胞漿內單精子顯微注射(IVF/ICSI)的臨床結局以及對子宮內膜容受性的影響。方法 將80例需IVF/ICSI助孕的PCOS患者隨機分為二甲雙胍組(A組)和對照組(B組)，A組患者于月經或撤退性出血的2～5 d開始口服二甲雙胍500 mg/次，3次/日，至取卵后第6天，B組不服用二甲雙胍。觀察比較兩組患者輔助生殖的相關參數，同時采集A組和B組中因卵巢過度刺激傾向未移植患者的子宮內膜組織，分別為A1、B1組，應用Western blot檢測同源框基因A10(HOXA10)和整合素β3(ITGB3)水平的表達。結果 A、B兩組Gn天數及其總量、獲卵數、正常受精率、優胚率及子宮內膜厚度差異均無統計學意義(P>0.05)，A組臨床妊娠率較B組顯著增高(P<0.05)，而HCG日雌二醇水平、周期取消率、流產率和卵巢過度刺激綜合征(OHSS)發生率均顯著降低(P<0.05)； A1組患者子宮內膜HOXA10和ITGB3蛋白表達水平均高于B1組(P<0.05)。結論 對于PCOS合并IR的不孕患者，二甲雙胍治療可以提高患者IVF/ICSI助孕時的臨床妊娠率，降低流產率和OHSS發生率，并改善子宮內膜容受性。

多囊卵巢綜合征(PCOS)；二甲雙胍；IVF/ICSI；子宮內膜容受性

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡婦女最常見的生殖內分泌和代謝紊亂性疾病之一，發病率高達6%～21%[1-2]。PCOS患者多數伴有胰島素抵抗(insulin resistance，IR)。二甲雙胍作為胰島素增敏劑，可降低患者的胰島素抵抗狀態，并可使部分PCOS患者恢復月經甚至誘發排卵而妊娠[3-6]。但對需行體外受精-胚胎移植技術助孕的PCOS患者，是否需要添加二甲雙胍治療，以及二甲雙胍治療后對患者妊娠結局、胚胎質量及子宮內膜容受性等方面的影響如何，目前研究結果尚存爭議。

為此，我們對需行體外受精/卵胞漿內單精子顯微注射(in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI)助孕治療的PCOS合并IR的不孕患者同時應用二甲雙胍治療，比較二甲雙胍組和對照組患者輔助生殖的相關參數，同時比較兩組患者子宮內膜容受性的分子標志物同源框基因A10(HOXA10)、整合素β3(ITGB3)的表達情況，探討體外受精-胚胎移植技術中二甲雙胍對PCOS合并IR的不孕患者的作用，以期為臨床治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年7—11月于鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心首次需行IVF/ICSI助孕的80例PCOS并IR患者為研究對象，按隨機數表法分為二甲雙胍組(A組，40例)和對照組(B組，40例)。PCOS的診斷標準參照2003年鹿特丹會議[7]制定。其中，A組患者均于月經或撤退性出血的2～5 d開始，于餐后30 min開始口服二甲雙胍500 mg/次、3次/d，至取卵后第6天，B組不服用二甲雙胍。1.2 試驗方法

1.2.1 激素測定 激素和內分泌相關指標的測定采用全自動化學發光免疫儀器測定血清促卵泡素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黃體生產素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)、孕激素(progestogen，P)、睪酮雄激素(testosterone，T)、胰島素(insulin，INS)。氧化酶法測定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。取卵后第6天再次測定T、INS、FBG的水平。采用穩態模式評估法(Homeostasis Model Assessment，HOMA)評估是否有IR：HOMA-IR=空腹血糖(mmoL/L)×空腹胰島素(mIU/L)/22.5。若HOMA-IR>2.69則判定為IR[8]。1.2.2 內膜采集 A組和B組中因卵巢過度刺激未移植的患者分為服藥A1組和未服藥B1組。兩組均于取卵后第6天行子宮內膜采集，存于液氮罐保存。采集前患者均簽署知情同意書，本研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會通過。隨機數字表法于兩組中各選取3例子宮內膜組織進行下一步實驗。

1.2.3 蛋白印跡 液氮罐中取出組織樣本，提取總蛋白，Western blot檢測子宮內膜組織HOXA10、ITGB3的表達并進行蛋白定量。以每泳道30 mg上樣，用10%的SDSPAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫下50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST漂洗10 min，3次，再用HRP標記二抗室溫孵育1 h，漂洗10 min，3次后ECL發光顯色，用化學發光成像系統分析結果。本實驗應用的抗HOXA10抗體和抗ITGB3抗體均購自美國Sigma公司。

1.3 觀察指標 ① A、B兩組患者IVF/ICSI助孕后Gn天數及用量、HCG日雌激素水平、獲卵總數、受精率、優質胚胎數、臨床妊娠率及卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)發生率等生殖相關參數；② A組患者內分泌的變化情況；③A1組、B1組PCOS患者子宮內膜HOXA10、ITGB3蛋白水平的表達。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料和基礎內分泌水平的比較 兩組患者年齡、不孕年限、BMI、基礎FSH、LH、E2、T及HOMA-IR差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料及基礎內分泌水平比較

2.2 A組患者治療前后T和HOMA-IR變化情況的比較 A組PCOS患者二甲雙胍治療前后T水平差異無統計學意義(P>0.05)，HOMA-IR治療后較治療前明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 A組患者治療前后T和HOMA-IR比較

2.3 兩組患者輔助生殖相關參數的比較 A組患者HCG日E2水平、周期取消率、流產率和OHSS發生率均低于對照組(P<0.05)，臨床妊娠率高于對照組(P>0.05)，Gn天數及其總量、獲卵數、正常受精率、子宮內膜厚度及優質胚胎率差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組患者生殖相關參數比較

2.4 兩組患者子宮內膜HOXA10和ITGB3蛋白表達水平的比較 Western blot結果顯示，A1組PCOS患者子宮內膜組織HOXA10、ITGB3蛋白表達水平高于B1組(P<0.05)。結果詳見圖1、表4。

圖1 A1、B1兩組患者子宮內膜HOXA10、ITGB3 western blot條帶圖

蛋白A1組B1組PHOXA100.85±0.040.56±0.070.004ITGB31.03±0.030.45±0.200.008

3 討論

PCOS發病機制至今尚未闡明，目前認為IR及其繼發的高胰島素血癥是PCOS病理生理的中心環節[9-10]。二甲雙胍因體外研究證實無致畸作用在PCOS患者治療中應用最為廣泛，多數研究證實了二甲雙胍治療PCOS患者的有效性，包括可降低PCOS患者高胰島素水平，使部分患者恢復月經周期和排卵，并顯著降低早期流產率。但在輔助生殖技術中，聯合二甲雙胍治療能否提高妊娠率，改善妊娠結局，目前尚存爭議。Tso等[11]研究結果顯示，在IVF中聯合應用二甲雙胍治療，臨床妊娠率及活產率無明顯提高。Kjotrod等[12]研究認為，二甲雙胍組臨床妊娠率、活產率較對照組顯著增加，而其他生殖相關參數無顯著差異。本研究結果顯示，二甲雙胍組PCOS患者的臨床妊娠率高于對照組(56.8%比36.4%，P<0.05)，流產率低于對照組(9.1%比25.0%，P<0.05)，但兩組患者的受精率、優質胚胎率無明顯差異(P>0.05)，提示二甲雙胍可能通過改善子宮內膜的容受性而改善臨床妊娠結局。

子宮內膜容受性是指子宮內膜允許胚胎黏附、侵入并誘導內膜間質發生一系列變化，最終使胚胎植入內膜的能力。研究顯示，PCOS患者胚胎著床期胞飲突、HOXA10、整合素β3、白血病抑制因子(LIF)、子宮內膜及內膜下血流等子宮內膜容受性標志物均降低[13-14]。子宮內膜組織為胰島素作用的靶器官之一，PCOS患者的IR和高胰島素血癥可以通過諸多途徑影響到子宮內膜組織，降低子宮內膜細胞增殖、分化的能力，使內膜容受性受損，從而導致著床困難或受孕后易流產。前期研究也顯示PCOS患者子宮內膜存在IR，二甲雙胍治療后子宮內膜組織的葡萄糖轉運蛋白-4水平增加，提示子宮內膜組織對葡萄糖的利用增加[15]。據此推測二甲雙胍可能通過增強組織對葡萄糖的利用，提高組織代謝水平而改善子宮內膜容受性。

隨后對IVF/ICSI中因OHSS傾向未移植的PCOS患者進行子宮內膜采集，用Western blot檢測二甲雙胍組及對照組子宮內膜組織HOXA10、ITGB3蛋白水平，HOXA10及ITGB3是目前被公認的代表子宮內膜容受性的分子表達物。研究結果顯示，二甲雙胍組HOXA10、ITGB3蛋白水平高于對照組，證實了二甲雙胍對子宮內膜容受性的改善作用。林丹等[16]對40例伴有胰島素抵抗的PCOS患者進行二甲雙胍治療，結果也顯示了二甲雙胍組PCOS患者ITGB3的表達高于對照組，認為二甲雙胍可改善PCOS患者子宮內膜容受性。但是，二甲雙胍究竟通過何種機制影響HOXA10、ITGB3的表達從而改善PCOS患者子宮內膜容受性，目前尚不明確，有待進一步深入研究。

[1] Boyle J A,Cunningham J,O'Dea K,et al.Prevalence of polycystic ovary syndrome in a sample of Indigenous women in Darwin, Australia[J].Med J Aust,2012,196(1):62-66.[2] Yildiz B O,Bozdag G,Yapici Z,et al.Prevalence, phenotype and cardiometabolic risk of polycystic ovary syndrome under different diagnostic criteria[J].Human Reprod,2012,27(10):3067-3073.

[3] Tang T,Glanville J,Hayden C J,et al.Combined lifestyle modification and metformin in obese patients with polycystic ovary syndrome. A randomized, placebo-controlled, double-blind multicentre study[J].Hum Reprod,2006,21(1):80-89.

[4] Tso L O,Costello M F,Albuquerque L E,et al.Metformin treatment before and during IVF or ICSI in women with polycystic ovary syndrome[J].Cochrane Database Syst Rev,2009,11(2):CD006105.

[5] Jr O F,Palomba S,Cascella T,et al.Improvement in endothelial structure and function after metformin treatment in young normal-weight women with polycystic ovary syndrome: results of a 6-month study[J].J Clin Endocrinol Metab,2005,90(11):6072.

[6] Palomba S,Russo T,Orio F Jr,et al.Uterine effects of metformin administration in anovulatory women with polycystic ovary syndrome[J].Hum Reprod,2006,21(2):457-465.

[7] Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome[J].Fertil Steril,2004,81(1):19-25.

[8] 邢小燕,楊文英,楊兆軍.胰島素抵抗指數在不同糖耐量人群中診斷代謝綜合征的作用[J].中華糖尿病雜志,2004,12 (3):182-186.

[9] Diamanti-Kandarakis E,Dunaif A.Insulin resistance and the polycystic ovary syndrome revisited: an update on mechanisms and implications[J].Endocr Rev,2012,33(6):981-1030.

[10]Bonakdaran S,Kiafar B,Barazandeh Ahmadabadi F,et al.Evaluation of insulin resistance in idiopathic hirsutism compared with polycystic ovary syndrome patients and healthy individuals[J].Australas J Dermatol,2016,57(1):e1-e4.

[11]Tso L O,Costello M F,Albuquerque L E,et al.Metformin treatment before and during IVF or ICSI in women with polycystic ovary syndrome[J].Cochrane Database Syst Rev,2014,(11):CD006105.

[12]Kjotrod S B,Carlsen S M,Rasmussen P E,et al.Use of metformin before and during assisted reproductive technology in non-obese young infertile women with polycystic ovary syndrome: a prospective, randomized, double-blind, multicentre study[J].Hum Reprod,2011,26(8):2045-2053.

[13]Lam P,Johnson I,Raine-Fenning N.Endometrial blood flow is impaired in women with polycystic ovarian syndrome who are clinically hyperandrogenic[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2009,34(3):326-334.

[14]Baracat M C,Serafini P C,Simoes Rdos S,et al.Systematic review of cell adhesion molecules and estrogen receptor expression in the endometrium of patients with polycystic ovary syndrome[J].Int J Gynaecol Obstet,2015,129(1):1-4.

[15]翟軍,孫瑩璞,劉春喜,等.二甲雙胍治療對PCOS患者子宮內膜胰島素抵抗的影響[J].河南醫學研究,2012,21(1):26-31.

[16]林丹,郭遂群,趙麗琴,等.鹽酸二甲雙胍對多囊卵巢綜合征患者排卵及子宮內膜容受性的影[J].海南醫學院學報,2014,20(4):528-530.

Influence of metformin on pregnancy outcomes and endometrial receptivity of patients with PCOS undergoing IVF/ICSI treatment

Sun Dongxia1,2, Wang Jingyuan1, Zhao Zheqi1, Chang Ziyin1, Zhai Jun1

(1.Department of Reproductive Medicine, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China; 2.Department of Reproductive Genetics, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng 252000, China)

Objective To explore the influence of metformin on pregnancy outcomes and endometrial receptivity of polycystic ovary syndrome (PCOS) infertile women with insulin resistance (IR) undergoing in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection (IVF/ICSI). Methods PCOS patients who underwent IVF/ICSI were divided into metformin group (group A) and control group (group B). Patients in group A

metformin with a dose of 500 mg tid from the second to fifth day of menstrual period or with drawal bleeding until the sixth day of ovum pick-up (OPU), and no metformin was provided for group B. The reproductive parameters of group A and B were compared. Endometrial tissue were from PCOS patients who were cancelled for the high risk of ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS) in IVF/ICSI. Endometrial tissue were divided into group A1(n=3) and B1 group (n=3), and western blot was used to detect the expression of HOXA10 and ITGB3. Results There was no significant difference of two groups in the number of days of Gn and its total, number of oocytes retrieved， normal fertilization rate, excellent embryo rate and endometrial thickness (P>0.05). The clinical pregnancy rate of group A was significantly higher than that of group B(P<0.05). Meanwhile, the E2 level on HCG day, cycle cancellation rate, miscarriage rate and the incidence of OHSS in group A were significantly lower than that of group B (P<0.05). The levels of HOXA10 and ITGB3 expression in A1 group were significantly higher than that of B1 group (P<0.05). Conclusion For PCOS infertility patients with IR in IVF/ICSI, metformin pretreatment can improve clinical pregnancy rate, reduce abortion rate and OHSS incidence, and improve endometrial receptivity.

polycystic ovarian syndrome; metformin; IVF/ICSI; endometrial receptivity

河南省省部共建項目(201601006)；河南省自然科學基金

翟軍，E-mail：bestzhai2005@163.com。

R 711

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.09.002

2017-02-01)

項目(162300410310)。