甘藍型油菜花粉母細胞減數分裂行為觀察

李東昊，姜 玲，阮 穎

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

甘藍型油菜花粉母細胞減數分裂行為觀察

李東昊，姜 玲，阮 穎

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

以甘藍型油菜“湘油15號”為材料，采用改良的卡寶品紅染色液對其進行花粉母細胞減數分裂過程的細胞學觀察。結果表明：當甘藍型油菜花蕾長度小于1.5 mm時，花粉母細胞大多處于減數分裂時期；而花蕾長度介于1.5～2.5 mm時，花粉母細胞大多已發育為單核花粉粒；相較于堿性品紅和Gimesa染色液，改良的卡寶品紅染色液著色效果更佳，核質區分明顯；甘藍型油菜花粉母細胞在經歷減數分裂Ⅰ和減數分裂Ⅱ后形成四分體，期間存在兩次胞質分裂。

甘藍型油菜；花粉母細胞；減數分裂

減數分裂是有性生殖的個體形成雌雄配子的一種特殊分裂方式[1]，對遺傳變異、生物進化等有著重要的生物學意義[2-3]。同時，它也是單倍體、多倍體遺傳育種[4-5]以及輻射誘變育種和敗育性研究[6]的理論基礎。

甘藍型油菜（Brassica napus L.）系十字花科蕓薹屬植物，是由二倍體的白菜型油菜（Brassia campestris L.）和甘藍（Brassica oleracea L.）自然雜交而成的異源四倍體[7]，在長江中下游流域廣為栽培，是非常重要的油料作物[8-9]。油菜減數分裂過程中雌雄配子發育的正常與否直接關系到產量的高低[10]。因此，筆者通過改良的卡寶品紅染色法對甘藍型油菜花粉母細胞減數分裂過程進行了較為完整的細胞學觀察，以期為研究甘藍型油菜減數分裂過程中染色體上組蛋白甲基化修飾的變化情況打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甘藍型油菜品種為“湘油15號”，由湖南農業大學植物發育與表觀遺傳調控實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 花蕾長度與小孢子母細胞發育情況觀察 油菜現蕾后，分別選取花蕾長7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0和小于1.0 mm的花進行染色和細胞學觀察。

1.2.2 改良品紅染色液制備 首先，制備原液A，將3 g堿性品紅溶于100 mL 70%酒精。然后，取原液A 10 mL加入到90 mL 5%石炭酸水溶液中制成原液B。接著，取原液B 55 mL，加入6 mL冰醋酸和6 mL福爾馬林（38%的甲醛）制成原液C。染色液工作液配制：取原液C 10 mL，加入80 mL 45%冰醋酸，再加入1.8 g山梨醇配成10%濃度的卡寶品紅染色液，靜置14 d，備用。

1.2.3 花粉母細胞減數分裂過程的觀察 油菜現蕾開花后，采集處于不同發育時期的花蕾；將采集的材料用卡諾固定液（酒精︰冰醋酸=3︰1）固定24 h，使用1 mol/L鹽酸60℃解離5 min；分別用Gimesa染色液、傳統的堿性品紅染色液和改良的卡寶品紅染色液進行染色（30 min），在顯微鏡下觀察并拍攝，比較3種染色液的著色效果。

2 結果與分析

2.1 花蕾長度與雄配子體發育時期的關系

從圖1中可以看出，當花蕾長度為1.5～2.5 mm時，約80%的花粉母細胞已發育為單胞花粉粒；而花蕾小于1.5 mm時，85%的花粉母細胞正處于減數分裂時期。因此，試驗選取花蕾小于1.5 mm的花粉母細胞進行細胞學觀察。

圖1 3種不同染色液不同長度的花蕾

2.2 3種不同染色液著色效果的比較

如圖2所示，Gimesa染色液著色不明顯，而傳統的堿性品紅染色液，盡管其著色較深，可以很好地觀察到染色質位置，但是缺點也很明顯，即在一些時期，不能很好地區分染色體狀態；相較于前兩者，改良后的卡寶品紅染色液可以較好地著色，以便清晰地觀察花粉粒形態和染色體行為。

2.3 甘藍型油菜花粉母細胞減數分裂過程觀察

對小于1.5 mm的花蕾進行染色和顯微觀察發現，跟大多數植物一樣，甘藍型油菜“湘油15號”的花粉母細胞歷經了分裂間期、減數分裂Ⅰ、減數分裂Ⅱ以及2次胞質分裂后，最終形成四分體。

圖2 3種不同染色液著色效果的比較

花粉母細胞首先進入減數分裂間期，此時細胞形態多為近似圓形。進入減Ⅰ前期：細胞核開始消失，染色質加深濃縮形成染色體，此時可以較為清楚地看到聯會的同源染色體（圖3A）。減Ⅰ中期：細胞核膜與核仁消失，紡錘體出現，染色體集中出現在細胞質中間的赤道板上，此時染色體排布有重疊現象不利于染色體的觀察（圖3B）。減Ⅰ后期：核內同源染色體由紡錘絲牽引，各自移向兩極，此時可以觀察到核內兩側有染色體的聚集（圖3C）。減Ⅰ末期：染色體解壓縮，染色質逐漸向中間聚集，細胞質分裂1次，形成2個大小均等的細胞質（圖3D）。二分體時期：減數第一次分裂后，核內染色質不進行復制，經短暫的間期后，分裂在2個子細胞的染色質再次濃縮形成染色體（圖3E）。減Ⅱ中期：各姐妹染色單體向細胞中部聚集，排布于赤道板上（圖3F）。減Ⅱ后期：姐妹染色單體由紡錘體牽引向兩側聚集（圖3G）。四分體時期：兩側聚集的染色體再次解濃縮，核膜核仁出現，細胞質進行第二次分裂，小孢子細胞質外形成胼胝質共同包圍形成四分體，至此減數分裂完成（圖3H）。

此后小孢子進一步發育直至形成具有細胞外壁的單核花粉粒。游離狀態下的單核花粉粒，形狀近似橢圓，細胞核大且集中，胞質濃厚，未觀察到明顯的液泡。

3 討 論

甘藍型油菜，尤其是在自然界穩定遺傳的甘藍型油菜[11]。在新合成的雙二倍體中，穩定的染色體配對通常是由遺傳控制（例如小麥、燕麥）的，或者是由染色體結構改變而獲得的（如棉花）[12-15]。盡管堿性品紅染色液染色效果出眾，但是對染色體與細胞質的區分效果較差。而改良后的卡寶品紅染色液能有效地解決這一問題，使染色體著色明顯強于細胞質，在觀察時很容易將兩者區分開來。

表觀遺傳學（epigenetics）是不同于傳統遺傳學的一個學科分支，其研究的主要內容是由非基因序列改變而引起的，在發育和細胞增殖過程中可以穩定傳遞的基因或者蛋白表達的變化[16-17]。染色體上組蛋白發生的共價化學修飾（甲基化，乙酰化等）也屬于表觀遺傳學的范疇[18]。因此，觀察花粉母細胞的減數分裂行為，有助于開展甘藍型油菜的表觀遺傳學研究。試驗結果顯示，在減數分裂Ⅰ和Ⅱ的前期、中期和后期可以很好地觀察到染色體的分布情況，為研究甘藍型油菜染色體上組蛋白甲基化修飾的變化情況打下了基礎。

圖3 “湘油15號”花粉母細胞減數分裂過程

[1] 李再云，劉后利. 甘藍型油菜減數分裂中的染色體行為觀察[J]. 華中農業大學學報，1994，13（4）：418-421.

[2] 呂 琳，何聰芬，董迎卯，等. 木立蘆薈小孢子母細胞減數分裂與花粉育性關系的初步研究[J]. 遺傳，2005，27（3）：429-434.

[3] 馮九煥，盧永根，劉向東，等. 水稻花粉發育過程及其分期[J]. 中國水稻科學，2001，15（1）：21-28.

[4] 張曉偉，高睦槍，原玉香，等. 人工合成甘藍型油菜研究[J]. 河南農業科學，2001，（2）：7-10.

[5] 錢 偉. 甘藍型油菜與白菜型油菜亞基因組問雜種優勢的研究[D].武漢：華中農業大學，2003.

[6] 葉紈芝，曹家樹，余小林，等. 白菜細胞核雄性不育兩用系的細胞學觀察[J]. 細胞生物學雜志，2004，26：516-522.

[7] 傅廷棟. 雜交油菜的育種與利用[M]. 武漢：湖北科技出版社，2000.

[8] 李培武，趙永國，張 文，等. 中國甘藍型油菜硫苷含量及組份分析[J]. 中國農業科學，2005，38（7）：1346-1352.

[9] Liu Z Q，Adamczyk K，Manzanarex-dauleux M，et al. Mapping PrBn and other quantitative trait loci responsible for the control of homeologous chromosome pairing in oilseed rape（Brassica napus L.）haploids[J]. Genetics，2006，174：1583-1596.

[10] 余鳳群，傅廷棟. 甘藍型油菜幾個雄性不育系的細胞形態學研究[J].武漢植物學研究，1990，8（3）：119-216.

[11] 楊光圣，瞿 波，傅廷棟. 三個甘藍型油菜隱性細胞核雄性不育系小孢子發生的細胞學研究[J]. 華中農業大學學報，1999，18（5）：520-523.

[12] Rajhathy T，Thomas H. Genetic control of chromosome pairing in hexaploid oats[J]. Nature New Biology，1972，239：217-219.

[13] Mursal I E. Endrizzi J E. A reexamintiton of the diploid like meiotic behavior of polyploid cotton[J]. Theor Appl Genet，1976，47：171-178.

[14] Jenczewski E，Eber F，Grimaud A，et al. A major gene controlling homeologous pairing in oilseed rape（Brassica napus）haploids[J]. Genetics，2003，164：645-653.

[15] 李 俊，方小平. 人工合成甘藍型油菜減數分裂中的染色體行為觀察[J]. 江西農業學報，2010，22（1）：1-4.

[16] 董玉瑋，侯進慧，朱必才，等. 表觀遺傳學的相關概念和研究進展[J].生物學雜志，2005，22（1）：1-3.

[17] 李光雷，喻樹迅，范術麗. 表觀遺傳學研究進展[J]. 生物技術通報，2011，1（1）：41-49.

[18] 于 紅. 表觀遺傳學：生物細胞非編碼RNA調控的研究進展[J].遺傳，2009，31（11）：1077-1086.

（責任編輯：成 平）

ObservationofPollenMotherCellMeiosisinBrassica napus

LI Dong-hao，JIANG Ling，RUAN Ying
（College of Biological Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

The cytoplasmic observation of pollen mother cell meiosis in Brassica napus Xiangyou 15 was carried out with the modified carbol fuchsin. The results indicated that when the length of buds is less than 1.5 mm, pollen mother cells mostly are in the meiosis period; and while the length of buds are between 1.5 mm and 2.5 mm, pollen mother cells mostly develop into mononuclear pollen grains. Compared with alkaline fuchsin and Gimesa, the modified carbol fuchusin is effective in pigmentation, with clear nucleus-cytoplasm distinction. And after the meiosisⅠand meiosisⅡ, pollen mother cells of Brassica napus develop into tetrads, along with cytokinesis twice.

Brassica napus; polen mother cell; meiosis

Q942.4

A

1006-060X（2017）05-0001-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.005.001

2017-03-05

作物種質創新與資源利用國家重點實驗室科學基金開放項目（12KFXM10）

李東昊（1992-），男，湖南長沙市人，碩士研究生，專業方向：植物發育與表觀遺傳。

阮 穎