回醫扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腦內細胞間黏附分子1和血管間黏附分子1表達的影響

劉 超 劉敬霞 田文榮 劉抒雯 甘佳樂 顧玉寶 王 楓

(寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004)

回醫扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腦內細胞間黏附分子1和血管間黏附分子1表達的影響

劉 超 劉敬霞1田文榮 劉抒雯 甘佳樂 顧玉寶 王 楓

(寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004)

目的 探討扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腦內細胞間黏附分子(ICAM)-1和血管間黏附分子(VCAM)-1表達的影響。方法 將60只雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組、扎里奴思方組，每組15只；除假手術組外，其余各組均給予高脂喂養4 w后，予10%的自體糞便1 ml/100 g灌胃，1次/d，連續3 d，造成痰熱腑實證模型，再采用線栓法制備大腦中動脈阻塞(MCAO)模型；大鼠給藥劑量尼莫地平組10.8 mg/kg、扎里奴思方組1.54 g/ml，制備MCAO模型前3 d灌胃給藥。大鼠分別于缺血再灌注后1、3、7 d取腦，取材前進行腦組織含水量測定，采用免疫組化法檢測缺血側海馬區ICAM-1、VCAM-1的表達,RT-PCR檢測ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的表達。結果 與假手術組比較，模型組腦組織含水量增高(P<0.01);ICAM-1、VCAM-1陽性細胞，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組腦組織含水量降低；ICAM-1、VCAM-1陽性細胞數減少，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達降低(P<0.01)。與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低，ICAM-1、VCAM-1陽性細胞數減少，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達降低(P<0.05)。結論 扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腦神經元起保護作用，其機制可能與抑制大鼠腦內ICAM-1和VCAM-1的表達有關。

扎里奴思方；腦缺血再灌注；痰熱腑實證；細胞間黏附分子1；血管間黏附分子1

腦梗死發生是一個復雜的快速級聯反應，其病理機制主要有氧自由基的產生、能量代謝障礙、鈣離子超載、炎性細胞浸潤等諸多環節〔1，2〕，其中炎癥反應促進了腦缺血損傷的發展，是腦和神經損傷的主要病理機制之一〔3〕。細胞間黏附分子(ICAM)-1和血管間黏附分子(VCAM)-1屬于免疫球蛋白超家族，是重要的炎癥因子，在炎性細胞因子和細菌內毒素的刺激下可在內皮細胞表面表達，介導白細胞的黏附和滲出，從而加劇腦缺血再灌注損傷〔4〕。腦缺血后ICAM-1和VCAM-1生成增多，促進白細胞向腦梗死區浸潤，而再灌注會加劇白細胞往梗死區遷移，加重炎性反應性損傷〔5〕。《回回藥方》中扎里奴思方具有芳香開竅、補腎益髓、化痰祛瘀之功，對缺血再灌注大鼠具有調控血腦屏障、抗腦缺血損傷和保護腦神經元等作用〔6〕。本研究從腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織含水量、ICAM-1和VCAM-1表達等方面探討扎里奴思方對腦缺血后神經元的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠，SPF級，3～4月齡，體重(300±50)g，寧夏醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(寧)2014-0001。飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心，溫度(25±1)℃，濕度(50±10)%，自由覓食飲水，適應性飼養7 d后進行實驗。

1.2 實驗藥物

1.2.1 扎里奴思方 組成：海狗腎(膃肭臍)12 g、安息香(阿你松)3 g、水龍骨(伯思八牙)12 g、肉桂(薩底知)12 g、菟絲子(阿夫忒蒙)12 g、石菖蒲(哈咱卜咱里刺)12 g、小茴香(法理公)12 g、乳香(兀沙吉)12 g、當歸(法忒刺撒里榮)12 g、沒藥(木里葉)12 g、懷牛膝(干祖伐)24 g、番紅花(撒法郎)12 g、蘆薈(拆不牙刺)12 g、牡丹皮12 g。由寧夏醫科大學附屬回醫中醫院提供制備。

1.2.2 尼莫地平片 規格30 mg/片，山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司。將尼莫地平研磨成細小的粉末狀，加入適量的生理鹽水混勻(1.08 mg/ml)灌胃。

1.2.3 高脂飼料〔7〕3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.12%丙硫氧嘧啶、2%吐溫-80、10%豬油、84.38%基礎飼料。

1.3 主要試劑和儀器 蒸餾水(寧夏醫科大學實驗動物中心)；膽固醇(鄭州興昌化工產品有限公司，批號：67784)；1，2-丙二醇(重慶博洋生物技術有限公司，批號：57854)；吐溫-80(重慶博洋生物技術有限公司)；豬油(自己購買)；TaKaRa RNA PCR試劑盒(TaKaRa公司)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；A4尼龍栓線(重慶博洋生物技術有限公司，批號：2832-A4)；多聚甲醛(重慶博洋生物技術有限公司)；兔二抗及二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑；電子天平(BT224S，Sartorius公司)。

1.4 分組與用藥 將60只雄性大鼠按隨機數字表法分為假手術組，模型組(痰熱腑實證腦缺血組)，尼莫地平組，扎里奴思方組，15只/組。除假手術組外，其他各組高脂飼料喂養4 w后給予10%自體糞便1 ml/100 g灌胃3 d，然后每組隨機抽選3只大鼠，腹主動脈采血，檢測大鼠血脂，若血脂出現異常為痰熱腑實證模型造模成功。然后制備局灶性大腦中動脈阻塞(MCAO)模型。假手術組、模型組給予生理鹽水灌胃，藥物治療組分別用相應藥物灌胃。大鼠用藥量根據生藥材含量按等效劑量換算關系，灌胃體積為1 ml/100 g，扎里奴思方為1.54 g/ml，尼莫地平10.8 mg/kg。大鼠術后每日用藥1次，術前12 h禁食不禁水。

1.5 局灶性腦缺血再灌注模型制作 參照Longa等〔8〕報道的線栓法制備MCAO模型。體積分數10%水合氯醛(300 mg/kg，灌胃)麻醉大鼠，置于試驗臺仰臥位固定，常規去毛消毒，取頸前正中切口，分離左側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈；結扎頸外動脈近心端和遠心端；于頸外動脈近頸總動脈分叉處用眼科剪剪一小口，將線栓穿入頸內動脈并向前推，線栓插入深度約(18.0±0.5)mm；插線成功后留出線栓約1 cm，結扎頸外動脈剪口處，縫合皮膚。術后2 h拔出線栓進行再灌注處理。假手術組只分離血管，不結扎，不插線栓。手術過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃，保持室溫(26±1)℃。

1.6 指標檢測

1.6.1 腦組織含水量測定 各組大鼠斷頭取左側缺血腦組織。首先電子天平稱濕重，然后將腦組織放入恒溫烤箱內烘干至恒重，稱取干重。根據Elliot公式計算，腦含水量%=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6.2 免疫組織化學法檢測ICAM-1和VCAM-1表達 采用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)免疫組織化學染色法檢測ICAM-1和VCAM-1在缺血海馬區的蛋白表達情況。按照試劑盒提供的實驗步驟操作：各組大鼠按規定時間灌注后取腦，石蠟包埋脫水，3%H2O2室溫10 min以滅活內源性酶；微波爐加熱至沸騰，熱修復抗原；滴加封閉液，室溫30 min；滴加1∶100工作濃度的一抗，4℃過夜；滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加SABC，37℃孵育30 min；DAB顯色；沖洗；復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。位于胞質或胞核內棕黃色或黃褐色顆粒為陽性表達。陽性細胞計數：在400倍光學顯微鏡下每張切片采用盲法隨機選取5個視野，分別計數免疫反應陽性細胞數，取平均值。

1.6.3 RT-PCR法檢測腦組織ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA 腦組織進行勻漿，加氯仿，離心，吸取上清液，加入異丙醇，離心，移去上清液，加入75%乙醇，清洗沉淀，離心，去除上清液，干燥RNA沉淀2～3 min，溶解RNA沉淀。使用Nanodrop2000超微量分光光度計測定A260/A280的比值，比值在1.9～2.1，計算總RNA 含量，取1 μg用于反轉錄。選用β-actin基因作內參照，按照2-△△Ct相對定量公式計算ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的含量。各引物序列、產物長度見表1。取細胞總RNA 2 μl，加雙蒸水2 ml，于分光光度計260 nm和280 nm處測吸光度(A)，A260/A280在1.9～2.1方可使用。反應條件，β-actin：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，72℃ 50 s，35個循環；ICAM-1：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，70℃ 50 s，34個循環；VCAM-1：94℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 52 s，40個循環。

表1 引物序列

1.7 統計學方法 應用SPSS17.0軟件，計量資料在比較前進行正態性及方差齊性檢驗，若符合正態性及方差齊性，則采用單因素方差分析，多組間兩兩比較用最小顯著差法(LSD-t)；若不符合正態性及方差齊性，則采用秩和檢驗。

2 結 果

2.1 腦組織含水量 模型組與假手術組比較各時間點大鼠腦組織含水量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，藥物組大鼠各時間點腦組織含水量降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低(P<0.05)；與1 d組比較，尼莫地平7 d組和扎里奴思方7 d組腦組織含水量均降低(P<0.05，P<0.01)；與3 d組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低(P<0.05)。見表2。

2.2 各組大鼠缺血側海馬區ICAM-1、VCAM-1的表達 模型組各時間點ICAM-1、VCAM-1陽性細胞表達較假手術組顯著升高(P<0.05,P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組ICAM-1、VCAM-1陽性細胞表達降低(P<0.05,P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組ICAM-1、VCAM-1陽性細胞表達降低(P<0.05)。見圖1，圖2，表3，表4。

2.3 對腦缺血再灌注大鼠腦組織ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組各時間點ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA

表2 各組大鼠腦組織含水量比較

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與尼莫地平組比較：3)P<0.05；與1 d組比較：4)P<0.05；與3 d組比較：5)P<0.01；下表同

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注后海馬區ICAM-1 陽性細胞變化(×400)

表達顯著降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達降低(P<0.05)。同組別不同時間點比較，尼莫地平7 d組ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達較1 d組降低(P<0.05)，扎里奴思方7 d組ICAM-1

表3 各組大鼠缺血側海馬區ICAM-1陽性數 細胞比較，個/視野)

表4 各組大鼠缺血側海馬區VCAM-1陽性 細胞數比較，個/視野)

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注后海馬區VCAM-1 陽性細胞變化(×400)

mRNA表達較1 d組降低(P<0.05)。見表5，表6。

表5 各組大鼠腦組織ICAM-1 mRNA表達相對含量的 比較

表6 各組大鼠腦組織VCAM-1 mRNA表達相對含量的 比較

3 討 論

《回回藥方》論扎里奴思方“可開竅，凈其渾身厚濁風痰，治療痰盛弱病”，具有芳香開竅、化痰祛瘀、補腎益髓之功，是回族醫學治療缺血性腦病的常用方劑之一〔9〕。腦血管疾病的發病率逐年升高，缺血性腦血管病約占全部腦血管病的70%〔10〕。細胞黏附分子是一類能介導細胞與細胞、細胞外基質相互黏附的膜表面糖蛋白，在炎癥和免疫反應等過程中起著重要的作用。在正常情況下，ICAM-1和VCAM-1很少表達或不表達，當發生腦缺血再灌注損傷時病變組織局部釋放炎性因子，促使ICAM-1和VCAM-1表達明顯升高，細胞間黏附性增加，造成白細胞與血管內皮細胞大量牢固黏附；白細胞可阻塞血管腔，減少血流量，進到血管外的白細胞可釋放自由基、蛋白水解酶及其他毒性物質，從而加重缺血區組織損傷〔11〕。ICAM-1可介導白細胞的黏附和聚集，增強炎性因子間的瀑布反應，加重炎性損傷的程度，最終引起梗死灶面積增大〔12〕。VCAM-1參與介導細胞與細胞或細胞與基質之間黏附，其介導白細胞與血管內皮細胞黏附，穿越血腦屏障，是造成腦缺血再灌注損傷的一種重要黏附分子。Cheng等〔13〕發現抑制VCAM-1的表達能縮小缺血半暗帶的范圍，減輕腦缺血再灌注損傷。因此，炎癥反應在缺血性損傷的病理機制中起到重要作用，參與了腦梗死的發生、發展和預后，所以下調炎性因子、阻止炎癥級聯反應，對神經細胞具有一定的保護作用〔14〕。

綜上，扎里奴思方對痰熱腑實證腦缺血再灌注大鼠腦神經元的保護作用可能與抑制腦內ICAM-1和VCAM-1表達有關。

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14 周天梅，佟麗妍，張衛華.續命湯對局灶性腦缺血中風大鼠血清白介素-1β和腫瘤壞死因子-α含量的影響〔J〕.中國中醫急癥，2014；23(2)：246-53.

〔2016-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

The effects of Hui Medicine Zhali Nusi Fang on the expressions of ICAM1 and VCAM1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion

LIU Chao,LIU Jing-Xia,TIAN Wen-Rong,etal.

Ningxia Medical University,Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the effects of Hui Medicine Zhali Nusi Fang on expressions of ICAM1 and VCAM1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion.Methods Sixty male SD rats were randomly divided into sham model,Nimodipine and Zhalinusi Fang groups(n=15).Except sham group,the other groups were fed with high fat diet for four weeks.Next,rat stools were administered intragastrically once a day for three days to make the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome,then focal cerebral ischemia models were established by middle cerebral artery occlusion with nylon thread.Rats were given with nimodipine(NMDP)(10.8 mg/kg),Zhali Nusi Fang(1.54 g/0.1 kg) by ig before the model preparation.The material at 1,3,7 days were obtained respectively, to determine brain water content before bringing out the rat brain.The expressions of ICAM1 and VCAM1 were observed by immunohistochemistry and RT-PCR methods.Results Compared with that of sham group,brain water content of model group rats was increased(P<0.01),the expressions of ICAM1,ICAM1 mRNA and VCAM1,VCAM1 proteins were upregulated(P<0.01).Compared with those of model groups,brain water content of ZLNSF and NMDP groups were reduced,the expressions of ICAM1,VCAM1 proteins and ICAM1,VCAM1 mRNA were decreased(P<0.01).Compared with those of NMDP group,the expressions of ICAM1,VCAM1 proteins and ICAM1,VCAM1 mRNA were decreased(P<0.05),especially the seven-day group(P<0.05).Conclusions Zhali Nusi Fang has protective effects against the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion,which might be related with inhibiting the expression of ICAM1 and VCAM1.

Zhali Nusi fang;Cerebral ischemia-reperfusion;Heat-phlegm andsthenic-fu syndrome;sICAM1;sVCAM1

國家十二五科技支撐項目(SQ2013SF12E02181)；國家自然科學基金資助項目(81260569)

劉敬霞(1970-)，女，博士，博士后，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事中醫藥防治老年病研究。

劉 超(1991-)，男，在讀碩士，主要從事中醫藥防治老年病研究。

R74

A

1005-9202(2017)11-2606-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.003

1 寧夏醫科大學回醫藥現代化省部共建教育部重點實驗室