槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷對阿霉素致體外心肌細胞損傷的保護作用

李希寧 吳 璇 周余來 楊錦竹 姜 波

(湖州師范學院醫(yī)學院，浙江 湖州 313000)

槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷對阿霉素致體外心肌細胞損傷的保護作用

李希寧 吳 璇1周余來2楊錦竹2姜 波3

(湖州師范學院醫(yī)學院，浙江 湖州 313000)

目的 觀察槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷對阿霉素(ADR)致心肌細胞損傷的保護作用及機制。方法 實驗選用出生24 h內的Wistar大鼠6只，雌雄不限，分離心肌細胞。采用純化培養(yǎng)的心肌細胞建立ADR損傷模型，實驗分為6組：空白對照組(正常細胞培養(yǎng)，加入等數量的MEM培養(yǎng)基，不加入任何藥物)、二甲基亞砜(DMSO)對照組(加入含DMSO濃度為5 μg/ml的MEM培養(yǎng)液)、ADR損傷組(加AOR濃度為1 μg/ml的MEM培養(yǎng)液)、槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷保護組(分別為低劑量12.5 μg/ml、中劑量25 μg/ml、高劑量50 μg/ml槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷保護組)。分組給藥后孵育24 h。顯微鏡下觀察心肌細胞形態(tài)，MTT法測定心肌細胞存活率，應用試劑盒分別檢測樣品中乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮合酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。結果 與ADR損傷組比較，低、中、高劑量保護組均可使心肌細胞存活率增高(P<0.01)，LOH活性降低(P<0.01或P<0.05)，NO活性降低(P<0.01)，SOD活性增強(P<0.01)。結論 12.5～50 μg/ml槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷均能減輕ADR對心肌細胞損傷，具有明顯的心肌細胞保護作用，其機制可能與其抗氧化作用有關。

阿霉素;心肌細胞損傷;槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷

阿霉素(ADR)是蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，廣泛應用于腫瘤治療，被認為是治療實體腫瘤最有效的藥物，但是有一定的心臟毒性作用，臨床上大多表現(xiàn)為心律失常、心包滲出、心肌功能障礙，長期使用甚至可導致充血性心力衰竭〔1〕。槲皮素-3-O-α-L吡喃鼠李糖苷為從櫻桃葉中分離鑒定的新化合物，屬黃酮類化合物〔2〕。黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎活性、抗菌活性、抗癌活性、免疫促進作用、降壓以及其他活性〔3〕。本實驗以體外純化培養(yǎng)的原代Wistar大乳鼠心肌細胞建立ADR損傷模型，觀察槲皮素-3-O-α-L吡喃鼠李糖苷對心肌細胞損傷的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和試劑 出生24 h內Wistar大鼠，清潔級，由吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心提供(動物飼養(yǎng)合格證號：No.0010281)；新生小牛血清、MEM培養(yǎng)基由Gibco公司提供；胰蛋白酶由Hyclone公司提供；鹽酸ADR為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產品；槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷由吉林大學藥學院藥物分析教研室楊錦竹老師提供；噻唑藍(MTT)、乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮合成酶(NOS)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均為南京建成生物有限公司產品。

1.1.2 試劑配制 基礎培養(yǎng)基：MEM培養(yǎng)基溶于1 000 ml新制備的超純水中，按培養(yǎng)基包裝上提示的量加入NaHCO3，調pH至7.2，超濾除菌，加入無菌青霉素(1.0×105U/L)、鏈霉素(100 mg/L)，分裝，工作液4℃保存，貯備液-20℃凍存。 常規(guī)培養(yǎng)基：內含新生小牛血清(15%，V/V)及HEPES(10 mmol/L)的MEM培養(yǎng)基。ADR損傷培養(yǎng)液：將ADR用含15%新生小牛血清的MEM培養(yǎng)液配制成2 μg/ml的培養(yǎng)液。槲皮素-3-O-α-L吡喃鼠李糖苷保護培養(yǎng)液：槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷用含15%新生小牛血清的MEM培養(yǎng)液分別配制成低、中、高劑量(25、50、100 μg/ml)的培養(yǎng)液。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠乳鼠心肌細胞的原代培養(yǎng) 取24 h內新生的Wistar大鼠，不限雌雄。在超凈臺內，剪開胸腔，擠出心臟，剪取心尖前2/3處，放入預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中。彎頭吸管反復沖洗心肌塊至無殘留血塊，轉移至另一無菌的培養(yǎng)皿中。剪碎至1 mm3小塊，轉移至錐形瓶中(內含轉子)。加入0.25%胰酶+0.1%EDTA溶液，37℃磁力攪拌器低速攪拌15 min，棄去上層液體。所留固形物再次加入0.25%胰酶+0.1%EDTA溶液，消化2～3次，每次15 min，至組織塊完全消失，僅留下絮狀物。收集所得的消化液(內含心肌細胞)，加含15%新生小牛血清的MEM培養(yǎng)液終止消化，過濾，1 200 r/min離心5 min。沉淀加入10 ml MEM培養(yǎng)液稀釋，輕輕吹打成單細胞懸液。移入培養(yǎng)瓶中，37℃差速貼壁90 min，除去混雜的成纖維細胞。未貼壁細胞調整濃度到2×105/ml，每孔200 μl接種至96孔板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，觀察細胞，當心肌細胞貼壁后，換液。48 h后，心肌細胞逐漸連接成片，并同步搏動。

1.2.2 實驗分組、造模及給藥方法 細胞培養(yǎng)48 h后分組給藥,每6孔為一組。分別為空白對照組、二甲基亞砜(DMSO)對照組、ADR損傷組、低、中、高劑量槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷保護組(12.5、25、50 μg/ml保護組)。空白對照組：96孔板中每孔加200 μl 含15%新生小牛血清的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，不加入任何藥物。DMSO對照組：給予100 μl 10 μg/ml DMSO培養(yǎng)液+100 μl 含15%新生小牛血清的MEM培養(yǎng)液。ADR損傷組：給予100 μl 2 μg/ml ADR損傷培養(yǎng)液+100 μl 含15%新生小牛血清的MEM培養(yǎng)液。低、中、高劑量保護組：給予100 μl 25、50、100 μg/ml的槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷保護培養(yǎng)液+100 μl 2 μg/ml阿霉素損傷培養(yǎng)液，保護藥濃度分別為12.5、25、50 μg/ml。

1.3 指標檢測

1.3.1 細胞形態(tài)學觀察 心肌細胞培養(yǎng)24 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、生長狀態(tài)以及細胞的搏動率。

1.3.2 MTT法測定細胞的存活率 各組心肌細胞接種于96孔板，每孔200 μl，每孔加入MTT溶液20 μl (5 g/L)，37℃繼續(xù)孵育4 h;棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩5 min，使結晶物完全溶解。選擇490 nm波長酶標儀檢測各孔吸光度(A)值。按下列公式計算各組細胞的存活率。存活率(%) =(實驗組A值-空白對照A值)/(對照組A-空白對照A值)×100%。

1.3.3 LDH含量的測定 心肌細胞給藥培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液，通過預實驗摸索出最佳取樣量為40 μl。不同組分裝入5 ml有蓋試管中后，按試劑盒說明加入各試劑，在紫外分光光度計(440 nm)測定吸光度，按試劑盒說明書所給公式計算培養(yǎng)液中的LDH含量。

1.3.4 NOS含量的測定 分組給藥24 h后，取培養(yǎng)液，按試劑盒說明加入試劑，利用紫外分光光度計(530 nm)測定吸光度，按試劑盒說明書所給公式計算培養(yǎng)液中的NOS的含量。

1.3.5 SOD含量的測定 心肌細胞分組給藥48 h后，將心肌細胞用Triton X-100進行破碎，不同實驗組樣品分別裝入5 ml的有蓋試管中，然后按照SOD檢測試劑盒說明書加入各試劑，利用紫外分光光度計(550 nm)測定吸光度，并計算各組SOD含量。

1.4 統(tǒng)計學方法 計量資料采用χ2表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗，多組間的比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 心肌細胞的形態(tài)學觀察 空白對照組：心肌細胞成多邊形生長狀態(tài)良好，細胞邊緣清晰，相互通過偽足連接成片，細胞間有相互耦聯(lián)的自主搏動，搏動穩(wěn)定。DMSO對照組多數細胞完整清晰，生長狀態(tài)較好，相互通過連接成片，自主搏動頻率穩(wěn)定，僅有極少數細胞出現(xiàn)連接減少，搏動頻率不穩(wěn)定。ADR損傷組細胞形態(tài)改變明顯，細胞皺縮，細胞的邊緣不清晰，細胞間連接被破壞，自主節(jié)律跳動不齊，偶見漂浮的細胞。保護組多數細胞邊緣清晰，仍有自主搏動。但部分細胞可見邊緣模糊，細胞間連接減少，自主搏動消失等破壞現(xiàn)象。見圖1。

2.2 槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷對ADR致心肌損傷的保護作用 與ADR損傷組比較，低、中、高劑量保護組均能有效提高心肌細胞存活率(P<0.01)，當保護組濃度為25 μg/ml，心肌細胞存活率最高。與ADR損傷組比較，低、中、高劑量保護組均能有效降低培養(yǎng)液中LDH活性(P<0.01或P<0.05)，當保護組濃度為25 μg/ml，細胞培養(yǎng)液中LDH活性最低。與ADR損傷組比較，低、中、高劑量保護組均能有效降低培養(yǎng)液中NOS活性(P<0.01)，當保護組濃度為25 μg/ml，細胞培養(yǎng)液中NOS活性最低。與ADR損傷組比較，低、中、高劑量保護組均能有效提高心肌細胞中SOD活性(P<0.01)，當保護組濃度為25 μg/ml，細胞中SOD活性最高。見表1。

空白對照組

DMSO對照組

ADR損傷組

中劑量保護組

低劑量保護組

高劑量保護組

組別細胞存活率(%)LDH濃度(U/L)NOS濃度(U/ml)SOD濃度(U/mg)空白對照組100.00±0.001200.90±10.604.005±0.11754.134±2.233ADR損傷組76.39±2.851)1443.19±20.851)4.719±0.3061)45.401±1.4141)DMSO對照組98.41±3.351211.40±25.354.015±0.20153.245±1.201低劑量保護組92.31±2.691)3)5)1381.49±20.691)4)5)4.282±0.12702)3)5)47.694±1.2131)3)5)中劑量保護組97.35±3.342)3)1244.54±11.341)3)4.010±0.1012)3)50.459±0.8842)3)高劑量保護組94.16±4.672)3)5)1279.16±25.672)3)5)4.180±0.1522)3)5)49.253±1.8292)3)5)

與空白對照組比較:1)P<0.01,2)P<0.05；與ADR損傷組比較:3)P<0.01,4)P<0.05；與中劑量保護組比較：5)P<0.05

3 討 論

ADR在臨床上廣泛應用于白血病、淋巴瘤、硬癌等的治療，效果顯著。對于在年輕人群中有高發(fā)病率而且有望治愈的腫瘤，如急性白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤及乳腺癌等疾病，蒽醌類藥物常常具有不可替代的作用。邵勁鋒等〔4〕研究結果表明，蒽醌類藥物治療Ⅲ期非霍奇金淋巴瘤有效率達80%。

過去曾認為大多數ADR所致心臟病變呈進展性和致命性、預后很差。張小花等〔5〕研究結果表明，蒽環(huán)類藥物化療后會使左心室收縮功能潛在受累。目前認為，蒽環(huán)類藥物引起的心臟病變，如果尚存較好代償能力并得到及時正確的治療，其長期預后并不太差；而對于心臟儲備較低的患者，病毒感染等應激狀態(tài)往往會加重病情甚至危及生命。然而由于心肌細胞再生代償能力極弱，而ADR所致心肌壞死或者細胞凋亡都是不可逆的，所以，研究ADR心臟毒性的機制具有重要意義。Muraoka等〔6〕研究表明，ADR導致心肌損傷的機制復雜。在應用ADR治療各種腫瘤時，如何能夠盡可能好地保護心肌細胞是一大課題。

槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷為從櫻桃葉中新分離鑒定的化合物，屬黃酮類化合物。槲皮素及其衍生物是植物界分布最為廣泛的黃酮類化合物,在多種植物的花、葉、果實中都可發(fā)現(xiàn),也是人類飲食中主要的生物類黃酮〔7〕。研究表明，槲皮素抗衰老、抗突變、抗動脈粥樣硬化等生物活性都與其抗氧化作用有一定關系〔8〕。隨著人類對槲皮素作用了解的深入,其抗氧化、抗自由基的作用及機制逐漸揭開。周蕾等〔9〕實驗表明，槲皮素保護組相對于柔紅霉素損傷組，能使脫落心肌細胞減少，降低心肌細胞凋亡率、LDH含量和MDA含量，升高SOD活性，即槲皮素能明顯減輕柔紅霉素對心肌細胞損傷,具有細胞保護作用。楊雷等〔10〕的研究結果顯示，槲皮素可以有效對抗過氧化氫引起的LDH活性增高，增強心肌細胞SOD的活性，得到了槲皮素可以對抗心肌細胞過氧化損傷，明顯保護心肌細胞的結論。由于槲皮素毒副作用小，越來越顯示出重要的臨床應用價值。槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖苷作為新分離鑒定的化合物，由于可在櫻桃葉這一豐富的植物資源中提取，為櫻桃葉的開發(fā)和利用提供了科學的依據。

1 徐久宏，張三典，高耀明，等.阿霉素對心肌細胞損傷的實驗研究〔J〕.蘇州大學學報(醫(yī)學版)，2008;28(1):47-9.

2 姜東莉.櫻桃葉中新黃酮類化合物的結構鑒定〔D〕.長春：吉林大學，2005.

3 宋玉喬，姚凌云，曹 蔚，等.槲皮素的藥理作用研究近況〔J〕.西北藥學雜志，2002;17(1)：40-2.

4 邵勁鋒，洪 專.BEPP方案一線治療Ⅲ期非霍奇金淋巴瘤〔J〕.實用臨床醫(yī)藥雜志，2005;9(8)：67-9.

5 張小花，姜志榮，李大海，等.蒽環(huán)類藥物對腫瘤患者左心功能影響的組織多普勒評價〔J〕.臨床超聲醫(yī)學雜志，2007;9(3)：151-3.

6 Muraoka S，Mura T.Free radicals mediate cardiac toxity induced by adriamycin〔J〕.J Pharmaceut Soc Japan，2003;123：855-66.

7 俞一心，戈升榮，王桂珍.槲皮素及其衍生物的藥理作用研究進展〔J〕.中國藥材，2003;26(12)：902-4.

8 王玉強，劉 慧，馬玉坤,等.槲皮素抗氧化作用研究進展〔J〕.齊魯藥事，2006;25(8)：488-90.

9 周 蕾，賴永洪.槲皮素對柔紅霉素致大鼠心肌細胞損傷的保護作用〔J〕.實用兒科臨床雜志，2006；21(13)：855-71.

10 楊 雷，郭青榜，盧 艷，等.槲皮素對過氧化氫所致體外心肌細胞損傷的保護作用〔J〕.中國臨床康復，2006；10(3)：60-2.

〔2015-12-11修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

湖州師范學院2014年人才科研啟動經費(RK30034)

李希寧(1986-)，男，博士，講師，主要從事代謝性骨病發(fā)病機制研究。

R972

A

1005-9202(2017)11-2612-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.005

1 吉林大學白求恩第一醫(yī)院 2 吉林大學藥學院 3 中國醫(yī)科大學轉化醫(yī)學研究院