不同劑量尼古丁對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織前列腺素E2表達及破骨細胞水平的影響

黃婉靈 杜 穎

(福建醫科大學附屬泉州第一醫院口腔科，福建 泉州 362000)

不同劑量尼古丁對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織前列腺素E2表達及破骨細胞水平的影響

黃婉靈 杜 穎1

(福建醫科大學附屬泉州第一醫院口腔科，福建 泉州 362000)

目的 探討不同劑量尼古丁對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織前列腺素(PG)E2表達及破骨細胞水平的影響。方法 160只SPF級SD大鼠按照隨機數字表法分為對照組、實驗1組、實驗2組及實驗3組，每組40只，分別給予0.9%氯化鈉溶液，0.50、0.75、1.00 mg/kg尼古丁酒石酸鹽腹腔注射；比較4組大鼠加力后1、3，5、7、14 d牙周組織PGE2表達及破骨細胞計數水平。結果 4組大鼠牙周組織中PGE2表達水平及破骨細胞計數隨加力時間延長而逐漸上升，且在加力后5 d達到最大，隨后又下降，差異均有統計學意義(均P<0.05)；4組加力后不同時間PGE2表達水平及破骨細胞計數組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，實驗3組>實驗2組>實驗1組>對照組，組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 尼古丁會導致大鼠正畸牙移動過程中牙周組織PGE2表達和破骨細胞形成水平上升，且隨劑量增加上升更明顯，故在正畸過程中應建議患者戒煙，并有效控制牙周炎癥。

尼古丁；正畸；牙周組織；前列腺素E2；破骨細胞

目前成人正畸患者已占牙齒矯治總數的15%～20%〔1〕。吸煙已被證實是牙齒矯治失敗的重要危險因素之一，這與香煙中尼古丁成分損害牙周組織健康、誘發牙周炎癥及促進牙槽骨吸收關系密切〔2〕；同時，前列腺素(PG)E2已被證實參與到正畸牙移動過程中骨質及牙周組織改建過程〔3〕；但正畸治療患者吸煙行為是否會加重牙周組織損傷，PGE2、破骨細胞水平在其中動態變化情況尚缺乏相關實驗證實。本次研究通過建立大鼠正畸牙移動+尼古丁干預模型，觀察牙周組織PGE2表達及破骨細胞計數水平變化，探討不同劑量尼古丁對大鼠正畸牙移動過程中牙周組織PGE2表達及破骨細胞水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 由西安交通大學動物實驗室提供SPF級健康雄性SD大鼠(合格證0015367)共160只，鼠齡64～70 d，體質量(200.0±10.0)g。實驗試劑與儀器：①兔抗鼠PGE2多克隆抗體，由福州邁新生物技術開發有限公司提供；②免疫組化檢測試劑盒，由北京博奧森生物技術有限公司提供；③二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒，由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；④pH7.4～7.6磷酸鹽緩沖液(PBS)，由泉暉貿易國際有限公司提供；⑤胃蛋白酶，由西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司提供；⑥尼古丁酒石酸鹽，由武漢豐竹林化學科技有限公司生產；⑦正畸拉簧，由杭州新亞齒科材料有限公司提供，規格0.012英寸；⑧結扎絲，由杭州愛麗思口腔醫療器材有限公司提供，規格0.2 mm；⑨德國Leica公司生產RM2235石蠟切片機；⑩日本OLYMPUS公司生產BX53型自動光學顯微鏡。

1.2 實驗方法 入選大鼠在高壓滅菌飲用水及飼料分籠喂養7 d后行腹腔注射麻醉，麻醉藥物為氯胺酮100 mg/kg；于上頜中切牙唇舌及第一磨牙近中軸頸緣處磨切淺溝，深度0.5 mm，再采用結扎絲對鎳鈦拉簧進行結扎，位置為上頜切牙和第一磨牙間，確保第一恒磨牙向近中移動矯治，鎳鈦拉簧規格長6 mm、直徑0.012英寸，力值約50 g。入選大鼠采用隨機數字表法分為對照組、實驗1組、實驗2組及實驗3組，每組40只，分別給予0.9%氯化鈉溶液，0.50、0.75、1.00 mg/kg尼古丁酒石酸鹽腹腔注射，5 s內注射完畢；每天定時查看加力裝置有無脫落，一旦發現應立即重裝。

1.3 觀察指標

1.3.1 組織取材和切片 分別于每組加力50 g后1、3、5、7、14 d后選取8只大鼠處死，處死方法采用心內灌注法；切取鎳鈦拉簧所在位置磨牙及切牙處上頜骨，固定24 h，固定液采用多聚甲醛；再采用螯合劑法脫鈣6～7 w，脫鈣液采用0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)；脫鈣完成后采用梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟浸沒及包埋，切片方向以第一磨牙近中根處作為矢狀面，切片厚度4～5 μm，并裱片于黏附載玻片上。

1.3.2 牙周組織破骨細胞計數 切片脫蠟后進行常規蘇木素-伊紅(HE)染色后，盲法下由兩名中級及以上職稱的病理科診斷醫師繼續閱片，光鏡下選取5個視野記錄破骨細胞個數，并計算平均值。

1.3.3 牙周組織PGE2表達 切片脫蠟后以3%過氧化氫水溶液浸泡10 min，超純水與PBS各沖洗2 min；放入37℃恒溫水浴箱以胃蛋白酶法進行抗原修復，時間30 min，再以超純水與PBS各沖洗2 min；滴加1∶400稀釋兔抗鼠PGE2多克隆抗體50 μl；4℃冰箱過夜，PBS沖洗3次，2 min/次，再滴加非生物素二抗，放入37℃恒溫水浴箱孵育30 min；最后以超純水與PBS各沖洗2 min，滴加DAB顯色，復染蘇木素1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明及中性樹膠封片；PG-E2陽性判定標準為細胞質內可見棕褐色顆?！?〕。自陽性區域選擇5個高倍視野，采用Imagine-proplus 5.0圖像分析軟件測定平均光密度(OD)值。

1.4 統計學方法 應用SPSS19.0統計學軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

4組大鼠牙周組織中PGE2表達水平及破骨細胞計數隨加力時間延長逐漸上升，且在加力后5 d達到最大，隨后又下降(P<0.05)；加力后不同時間PGE2表達水平及破骨細胞計數組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其中實驗3組>實驗2組>實驗1組>對照組(P<0.05)。見表1，表2。

表1 4組大鼠不同時間點牙周組織PGE2表達水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與實驗1組比較：2)P<0.05；與實驗2組比較：3)P<0.05；加力后5 d與本組其他時間點比較：4)P<0.05

表2 4組大鼠不同時間點牙周組織破骨細胞計數水平比較±s,n=40,個)

3 討 論

有報道顯示，尼古丁可對骨質改建產生不利影響，并可加速骨質吸收進程；同時吸煙人群牙周附著喪失率約為未吸煙人群的3～4倍，進一步證實尼古丁在牙槽骨喪失過程中發揮著重要作用，是導致牙周損傷加重的獨立危險因素之一〔5〕。已有研究證實，正畸牙移動主要依靠牙周組織改建方可完成，而牙周組織在受到機械刺激時機體PGE類合成增加，可激活牙周炎癥反應，進而為牙周組織改建創造良好環境；其中E2是公認正畸牙移動過程骨質吸收和形成穩態的關鍵調節物質之一〔6〕。而國外學者認為，尼古丁可顯著刺激牙齦成纖維細胞PGE2合成釋放，具有明顯劑量及時間依賴性〔7〕，說明吸煙誘發骨質吸收可能與干擾骨質代謝、降低牙周血流、促進PGE釋放及刺激破骨細胞分化成熟有關。也有實驗研究證實，較正常動物模型，尼古丁可增加正畸牙齒移動速度及移動量，這一效應亦呈明顯劑量及時間依賴特征；同時其還能夠提高破骨細胞合成數量，提高自身骨質吸收能力〔8〕。筆者認為這一現象可能與尼古丁除具有調節牙槽骨代謝作用外，還能夠刺激牙周血管管徑縮小、降低牙周膜血流分布量有關。此外，其對于牙周組織中破骨細胞骨吸收增強作用亦可增加正畸牙齒移動速率〔9〕。

相關研究顯示〔10〕，正畸牙移動過程中，骨吸收是由破骨細胞介導，而牙根吸收則是由破牙骨質細胞介導，本研究結果提示尼古丁注射會增加破骨細胞數量及PGE2表達水平，且與劑量呈正比。可能是因為尼古丁可加速正畸牙骨質吸收，可能與改變PGE2表達有關，因正畸牙移動過程中PGE2主要于破骨細胞內表達，間接提示尼古丁對于局部牙周組織炎癥反應水平及骨質吸收水平的影響情況。

本研究結果還說明正畸牙移動過程中骨質改建、吸收交替進行；而且尼古丁對于牙周組織損傷作用具有劑量相關性。Vandevska-Radunovic等〔11〕建立類似模型中，HE染色下隨加力時間的延長，牙根周圍炎性細胞浸潤程度增加，壓力側、張力側以及分叉處牙根表面開始出現吸收陷窩、破牙骨質細胞；且隨尼古丁注射的劑量越大，牙根表面吸收陷窩加深，且破牙骨質細胞顯著增加，與本次研究趨勢基本相符。因此，在正畸過程中應建議患者戒煙，并進行有效牙周炎癥控制。

1 Hasegawa M,Adachi T,Takano-Yamamoto T.Computer simulation of orthodontic tooth movement using CT image-based voxel finite element models with the level set method〔J〕.Comput Methods Biomech Biomed Engin,2016;19(5):474-83.

2 Iglesias-Linares A,Moreno-Fernandez AM,Yanez-Vico R,etal.The use of gene therapy vs.corticotomy surgery in accelerating orthodontic tooth movement〔J〕.Orthod Craniofac Res,2011;14(3):138-48.

3 Silvola AS,Varimo M,Tolvanen M,etal.Dental esthetics and quality of life in adults with severe malocclusion before and after treatment〔J〕.Angle Orthod,2014;84(4):594-9.

4 祖麗呼瑪·阿熱甫江,潘 旭,米叢波.正畸相關性牙根吸收的早期診斷與預防〔J〕.中國實用口腔科雜志,2012;9(5):564-9.

5 潘 旭,米叢波,劉 紅,等.正畸牙移動過程中牙周組織白細胞介素8的表達〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2011;15(20):3737-40.

6 Sodagar A,Donyavi Z,Arab S,etal.Effect of nicotine on orthodontic tooth movement in rats〔J〕.Am J Orthod Dentofacial Orthop,2011;139(3):e261-5.

7 Dudda M,Hauser J,Muhr G,etal.Low-intensity pulsed ultrasound as a useful adjuvant during distraction osteogenesis:a prospective,randomized controlled trial〔J〕.J Trauma,2011;71(5):1376-80.

8 潘 旭,祖麗呼瑪·阿熱甫江,米叢波,等.不同劑量尼古丁對正畸牙移動速度的影響〔J〕.新疆醫科大學學報,2013;36(6):811-3.

9 Xie LK,Wangrangsimakul K,Suttapreyasri S,etal.A preliminary study of the effect of low intensity pulsed ultrasound on new bone formation during mandibular distraction osteogenesis in rabbits〔J〕.Int J Oral Maxillofac Surg,2016;40(7):730-6.

10 楊 梅,向學熔,葉 國,等.低強度超聲對大鼠牙槽骨改建過程中COX-2和PGE2表達的影響〔J〕.第三軍醫大學學報,2016;38(8):829-34.

11 Vandevska-Radunovic V,Murison R.Emotional stress and orthodontic tooth movement:effects on apical root resorption tooth movement and dental tissue expression of interleukin-1 alpha and calcitonin gene-related peptide immunoreactive fibers in rats〔J〕.J Eur Orthod,2010;32(3):329-35.

〔2017-01-20修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

黃婉靈(1968-)，女，副主任醫師，主要從事口腔正畸研究。

R78

A

1005-9202(2017)11-2615-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.006

1 泉州醫學高等?？茖W校口腔醫學系基礎教研室